Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Спектрофотометрия препаратов ;ДНК, РНК и белков
Определение концентрации белка по собственной флуоресценции

Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении поглощения или испускания света в ультрафиолетовой области спектра. Для абсорбционой УФ-спектрофотометрии белков существуют некоторые проблемы, поэтому гораздо чаще определяют связавшиеся с определёнными красителями белки колориметрически в видимой области спектра (см. тему 10), либо в УФ свете измеряют эмиссию.

Растворы белка обладают поглощением в интервалах длин волн 270290 и 200-225 нм. Поглощение при 280 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот - тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина. Абсорбция при λ=210 нм, обусловленная пептидными связями в белках, практически в 20 раз выше, чем при 280 нм.

Поскольку поглощение в ультрафиолетовой области при 21 0 нм обусловлено в основном пептидными связями, то для разных белков величина поглощения различается незначительно. Определение общего белка в сыворотке крови с помощью прямой фотометрии при длине волны 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. Однако данный метод применяется сравнительно редко из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

В сравнении с фотометрией при λ=210 нм точность и специфичность методов определения белков, основанных на поглощении при λ=280 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках. Кроме того, присутствие в сыворотке крови свободных аминокислот - триптофана и тирозина, а также мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определённую погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке крови. Однако для препаратов белка с той или и иной степенью очистки его удобно использовать (прил. 17). Примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов будет влиять на определение.

Кроме адсорбции в УФ свете измеряют также эмиссию. Приведённый ниже метод полезен при очень низких концентрациях белка, имеющегося в малых количествах. Главное, что он не требует предварительного окрашивания полученного образца белка (необратимого, см. тему 10), так как раствор белка обладает собственной флуоресценцией.

Материалы и оборудование

Спектрофлуориметр, кварцевая кювета объёмом 3 мл, микропипетка, буферный раствор, раствор белка в буферном растворе, навеска 9 мг белка бычьего сывороточного альбумина (БСА) для калибровки.

Методика

1. Получить спектр флуоресценции раствора исследуемого белка с длиной волны возбуждения 280 нм, сканирование эмиссии в интервале 310-360 нм. Режим сканирования (флуоресценция, по регистрации, коррекция полная, шаг 1 нм) определяется по значению в максимуме флуоресценции при выключенной коррекции (10-90 единиц). Если в области 330-340 нм (при полной коррекции) наблюдается пик интенсивности флуоресценции, то определение концентрации возможно, в противном случае концентрация белка слишком низкая, и его нужно концентрировать.

2. Записать значение интенсивности флуоресценции I и длину волны эмиссии X в максимуме кривой флуоресценции. Снять спектр для буфера в отсутствии белка с теми же параметрами. Записать значение интенсивности флуоресценции 1₀ на найденной длине волны X. Вычислить значение I-I_o.

3. Используя буферный раствор, приготовить методом последовательного разведения растворы белка для калибровки с концентрациями от 3x100 мг/мл до 3х10-⁶мг/мл с шагом в 1 порядок, каждый объёмом по 2,7 мл. Для каждого раствора определить I-I_o, затем, используя MS Excel построить калибровочный график зависимости концентрации белка от I-I_o.

4. По калибровочному графику определить концентрацию раствора исследуемого белка.