Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Электрофорез нуклеиновых кислот
Приготовление агарозного геля

Электрофорез - это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных растворов) в жидкой среде под действием электрического поля. Впервые это явление было открыто профессорами Московского университета П.А. Страховым и Ф.Ф. Рейссом в 1809 году.

Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом для разделения, идентификации и очистки интактных молекул ДНК и их фрагментов (высокомолекулярная хромосомная ДНК всегда фрагментируется при изоляции из клетки). Агароза - фракция природного полисахарида агара.

ДНК - это слабая кислота, поэтому она движется к аноду («+») за счёт отрицательно заряженных фосфатных групп. За движением ДНК (РНК) в пластине геля можно следить, так как полосы окрашенной флуоресцентными красителями ДНК, формируемые молекулами одного размера при продвижении через поры геля, видны в УФ свете. Для окрашивания ДНК применяют краситель бромистый этидий EtBr (λ_max = 590 нм). Молекулы EtBr интеркалируют в молекулы ДНК, т.е. встраиваются между соседними парами нуклеотидов. Интенсивность флуоресценции связанного EtBr в 20 раз выше, чем свободного. Такая окраска обеспечивает высокую чувствительность: от 10 нг ДНК можно увидеть в виде полоски оранжевого цвета. Применяют и другие красители, в частности SYBR Green (λ_max = 497 нм). Длина волны прибора для визуализации ДНК УФ-трансиллюминатора - 305-320 нм.

Скорость движения ДНК (РНК) через поры агарозного геля при электрофорезе определяется размером молекул и их конформацией. Молекулы линейной двухцепочечной ДНК перемещаются в толще геля со скоростями обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс. Впереди мигрируют низкомолекулярные фрагменты, крупные молекулы движутся медленнее из-за большего сопротивления. Из нативных молекул НК быстрее всего движется тРНК размером 70-90 нуклеотидов и 5S рРНК размером 120 нуклеотидов. Наиболее крупные фрагменты геномной (хромосомной, ядерной) ДНК могут достигать размеров 100000 п.н. Для определения размера фрагментов используют маркеры молекулярного веса (DNA Ladder), которые наносят в соседние лунки геля.

Заливка геля. Агароза легко плавится при нагревании до 95 ^oC (в электрофорезном буфере). При выливании расплава в форму и его застывании получаются прозрачные упругие гели. Лунки (карманы) для внесения ДНК на гель-электрофорез формуются путём вставки тефлоновой гребёнки с зубьями в незастывший гель и её извлечением после полимеризации пластины геля.

Концентрация агарозы в геле. Скорость движения ДНК в порах геля зависит от концентрации агарозы. Зная размеры молекул ДНК в смеси, можно подбором концентрации добиться их наилучшего разделения (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость эффективности разделения фрагментов ДНК от количества агарозы в геле

Окраска ДНК в агарозных гелях. Для визуализации ДНК применяют её окрашивание бромистым этидием EtBr (3,8-диамино-5-этил-6-фенил-фенантридиум бромид). Молекулы красителя интеркалируют (встраиваются) между соседними парами нуклеотидов ДНК. Этидиум бромид добавляют обычно в расплав агарозы до полимеризации гелевой пластины. Максимум поглощения EtBr наблюдается при длинах волн 300 и 360 нм, а эмиссия происходит в красно-оранжевой области видимого спектра при 590 нм.

Материалы и оборудование

Агароза, гребёнка, форма для заливки горизонтального геля (т.н. «плашка», можно использовать крышку от иммунологического планшета).

Растворы

- 5х электрофорезный буфер ТВЕ. На приготовление 1 л буфера: Tris-OH (основание) - 54 г; борная кислота - 27,5 г; 0,5M ЭДТА, pH 8,0 - 20 мл.

- EtBr. Раствор 10 мг/мл в воде. Хранить в темноте в холодильнике.

Методика

1. Взвесить рассчитанное количество порошка агарозы (1 г для подготовки 100 мл 1% геля^а) и высыпать в химический термостойкий стакан. Налить в стакан 20 мл 5х электрофорезного буфера ТВЕ и довести до 100 мл водой.

2. Нагреть смесь на электроплитке или СВЧ-печи до полного расплавления.

3. Охладить расплав до 50-60°С (стакан можно держать в руках). Добавить EtBr до конечной концентрации 0,5 мкг/мл: лаборанту следует взять 5 мкл из стокового раствора EtBr с концентрацией 10 мг/мл б на 100 мл расплава.

4. Установить гребёнку ≈ в 1 см от края формы. Вылить расплав, перемешав.

5. После того как гель полностью полимеризуется (30 мин) осторожно удалить гребёнку, покачав её из стороны в сторону и потянув вверх.

Примечания

^а Расход геля для различных типов плашек: плашка размером 11x11см примерно 110-140 мл, крышка от иммунологического планшета - около 30 мл.

^б Бромистый этидий - потенциально опасное вещество из-за возможности связывания с ДНК и стимулирования разрывов в ДНК при освещении ультрафиолетом. Строгих доказательств нет, однако некоторые продукты его окисления ферментами печени обладают небольшой, но заметной мутагенной активностью. Необходимо работать в резиновых перчатках, соблюдая меры предосторожности! Избегать контакта с кожей! EtBr разрушается на свету, поэтому гели непродолжительное время хранят в темноте при +4 ◦С.