Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Электрофорез нуклеиновых кислот
Гель-электрофорез ДНК
Буфер для нанесения образцов на гель. Раствор ДНК в лунки геля вносят в буфере, содержащем глицерин или сахарозу, чтобы ДНК сразу опустилась на дно лунки, а не растворилась в электрофорезном буфере ещё до включения тока и вхождения в гель. Чтобы следить за прохождением фронта фореза в буфер добавляют специальные красители. Электрофоретическая подвижность бромфенолового синего (БФС) лежит в районе 100 оснований. Синее пятно БФС движется на уровне тРНК, это лидирующий краситель. Подвижность ксиленцианола (КЦ, зеленого цвета) лежит в районе 460 нуклеотидов.
Количество ДНК на дорожку геля. Нижний предел визуализации ДНК определяется используемым методом ее детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то можно увидеть от 10 нг ДНК в полоске шириной 5 мм. Слишком большое количество ДНК на дорожке геля («перегруз», >1 мкг) приводит к изменению подвижности полосы, которая движется быстрее, и к размыванию полос. Количество ДНК, которое можно внести в лунку, зависит от числа и размера фрагментов ДНК. Обычно вносят 0,2-0,5 мкг ДНК в лунку.
Геномная ДНК в отличие от плазмидной и фаговой всегда дает шлейф из фрагментов разного размера. В УФ свете наблюдается равномерное окрашивание по всей длине геля, так называемый «шмер» (от англ. smear - пятно, мазок). На дорожке 3 в прил. 13 можно видеть такой шлейф.
Электрофорезные буферы. Обычно применяют буферы, содержащие 50мМ Tris-ацетат, Tris-борат или Tris-фосфат с рН 7,5-8,0. Чаще всего их готовят концентрированными и хранят при комнатной температуре. Tris-боратный и Tris-фосфатный буферы имеют большую ёмкость и дают более хорошее разрешение, но если дальше нужно проводить ДНК-гибридизацию или секвенирование используется Tris-ацетатный буфер.
Напряжённость поля. Эффективное разделение фрагментов ДНК происходит при напряжённости, не превышающей 5 В/см геля. С увеличением напряжённости эффективность разделения ДНК ухудшается. При повышенной температуре молекулы ДНК особенно легко теряют краситель EtBr, что происходит, если проводить электрофорез при высоком напряжении. Этидиум бромид при электрофорезе движется от «+» к «-», т.е. в направлении, обратном движению ДНК. Чтобы он не уходил из геля, когда, к примеру, ДНК внесена в малом количестве, нужно ввести его прямо в буфер.
Подвижность разных форм ДНК. Двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации будут двигаться с разной скоростью. Так, кольцевая суперспирализованная форма плазмиды, кольцевая с одноцепочечным разрывом и линейная форма плазмиды движутся в агарозном геле с разными скоростями (прил. 9).
В 1% агарозном геле одноцепочечная ДНК (и РНК) движется примерно на 10% быстрее, чем двухцепочечная ДНК того же размера. Эта ДНК (РНК) окрашивается бромистым этидием примерно в 4-5 раз слабее, что необходимо учитывать при визуальной оценке результатов электрофореза.
Материалы и оборудование
Агарозный гель, раствор ДНК бактериального, растительного или животного происхождения, полученный в работах 1.1-1.3, маркер молекулярного веса (коммерческий препарат) или ДНК фага λ, рестрицированная Hindill, источник тока, камера для э/фореза, УФ-трансиллюминатор.
Растворы
- 10х буфер для нанесения образцов: 0,025 г бромфенолового синего БФС; 4 мл глицерина; 5 мл 0,5М ЭДТА, pH 8,0; довести до 10 мл бидистиллятом.
Методика
1. Поместить плашку с гелем в электрофорезную камеру, залить 1х буфер ТВЕ (работа 3.1) так, чтобы он полностью покрыл агарозу а.
2. Смешать 10 мкл раствора ДНК и 1 мкл 10х буфера для нанесения образцов на гель в пробирке, в лунке малого иммунологического планшета или просто на поверхности тефлоновой гребёнки. Тщательно пипетировать.
3. Нанести образец(ы) микропипеткой в лунку геля.
4. Нанести маркер молекулярного веса в соседнюю лунку геля.
5. Включить источник тока и провести электрофорез при напряжении 100 В в течение 1,5-2 ч (до выхода лидирующего красителя БФС из геля).
6. Отключить ток, вынуть плашку и просмотреть гель в УФ свете.
7. Сфотографировать гель цифровой фотокамерой б (фото см. в прил. 13).
Примечания
а Слой буфера над агарозой должен быть до 5 мм, иначе гель может «обсохнуть».
б Агарозные гели с ДНК, в отличие от полиакриламидных с белками, следует фотографировать сразу, поскольку при хранении полосы ДНК (ДНК-бэнд) становятся размытыми из-за диффузии. Как показывает опыт на следующее утро полосы нечёткие.