Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Определение С-концов гидразинолизом

Белки и пептиды при нагревании с безводным гидразином подвергаются гидразинолизу. При такой обработке расщепляются все пептидные связи, и все аминокислоты, составлявшие пептидную цепь, превращаются в гидразиды, за исключением С-концевой, присутствующей в реакционной смеси в виде свободной аминокислоты [13].

МЕТОДИКА

1. Обезвоживание гидразина. 100 г гидразинсульфата и 130 г NaOH смешивают в колбе и смесь перегоняют на масляной бане. Фракцию, полученную при 115°С и содержащую безводный гидразин, еще раз перегоняют над твердым NaOH.

2. Гидразинолиз пептидов. К высушенному пептиду добавляют несколько капель безводного гидразина, запаивают в толстостенной ампуле и инкубируют 6—16 ч при 115°С. По окончании инкубации пробу быстро упаривают в вакуумном эксикаторе над концентрированной H₂SО₄. Остаток растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и смешивают с равным объемом бензальдегида. Образуется густая эмульсия, которую можно разделить на фракции лишь центрифугированием. Бензальдегидную фазу удаляют с помощью тонкого капилляра, а водную фазу упаривают. Остаток растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и хроматографируют в бутанольной системе.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Асп и Глу в ходе реакции почти полностью разрушаются; Apr теряет гуанидиновую группировку и превращается в Орн, Цис разрушается, а Мет окисляется в соответствующий сульфон.

2. При коротком гидразинолизе может отщепиться С-концевой пептид.

3. После встряхивания реакционной смеси с бензальдегидом эмульсию можно поместить в капилляр, запаять его и центрифугировать при низких скоростях. При этом коричневая бензальдегидная фаза и почти бесцветная водная фаза разделяются с четкой границей. Капилляр надламывают по этой границе и отбирают водную фазу для анализа сразу или после предварительного концентрирования.

4. Динитрофенилированием или дансилированием водной фазы после встряхивания с бензальдегидом можно определить С-концевую аминокислоту в виде соответствующего ДНФ- или ДНС-производного. Этот метод особенно удобен для белков, когда концентрация свободных аминокислот в водной фазе весьма мала.

5. Реакция гидразинолиза возможна и в количественном варианте. Правда, в ходе реакции часто могут возникать артефакты, а выход реакции, за некоторыми исключениями, равен 85%. Поэтому, если в результате получают С-концевой остаток в количестве, меньшем 0,5 эквивалента, следует применить другой аналитический метод для того, чтобы решить, является ли обнаруженная аминокислота действительно С-концевой или же это артефакт.