Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Выделение и очистка белков
Оценка полноты очистки белков
Количественное определение белков

Для контроля степени очистки и для оценки качества конечного препарата необходимы прежде всего надежные методы количественного определения белка. Широкое распространение получило определение белка по количеству азота в осадке, образующемся при добавлении трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В 10%-ной ТХУ происходит полное осаждение подавляющего большинства белков. Следует лишь иметь в виду, что при очень низких концентрациях белка (например, менее 1 мг/мл) не всегда удается количественно определить и без потерь промыть осадок. Азот белка можно определять либо непосредственно в осадке, либо по разности содержания азота в растворе до и после осаждения белка с помощью ТХУ. Последний, «косвенный», вариант пользуется большей популярностью, так как позволяет избежать трудностей, связанных с собиранием и промыванием малых по объему осадков. Однако он малопригоден при наличии в растворе больших концентраций азотсодержащих веществ, не осаждаемых ТХУ. Само определение азота ведется по классическому методу Кьельдаля или с помощью его модификаций (микроварианты, метод Конвея и др.). Метод сводится к кипячению белка с концентрированной серной кислотой и сульфатом калия в присутствии катализаторов (сульфат меди, соли селена или ртути) до полного перехода азота в сульфат аммония с последующим превращением его в аммиак (добавлением щелочи), отгонкой и количественным определением последнего (титрометрически или с помощью цветных реакций). Подробное описание метода можно найти во многих практических руководствах по биологической химии. Здесь заметим лишь, что необходима осторожность в расчете количества белка по количеству обнаруженного азота. Применяемый для этого пересчетный коэффициент 6,25 является средней величиной. Как уже указывалось выше, для ряда белков наблюдаются существенные отклонения от среднего уровня содержания азота. Особенно велики они у основных белков клеточного ядра — расхождения в этом случае могут быть более чем двукратными. Как правило, однако, отклонения не превышают 5—10%.

Определение содержания белка по количеству азота является относительно громоздкой процедурой. Для определений по ходу очистки с успехом можно использовать более простые, хотя и менее надежные методы. Хорошие результаты дает применение методов, основанных на так называемой биуретовой реакции. Сущность этой цветной реакции будет рассмотрена позже. Здесь укажем лишь, что интенсивность развивающейся окраски является функцией числа пептидных связей в белке и практически не зависит от других его компонентов. Поэтому эффективность реакции более или менее постоянна при переходе от одного белка к другому. Описаны микроварианты этого метода, позволяющие количественно определять белок в концентрациях 0,15 мг/мл и более. Особого внимания заслуживает модификация Ицхаки и Гилла, в которой колориметрия продуктов реакции ведется в ультрафиолетовом свете при λ = 310 ммк.

Широкое распространение получил также метод Лоури, в котором сочетаются две реакции — на ароматические аминокислоты (с реагентом Фолина) и биуретовая. Его чувствительность значительно выше — до 0,01—0,05 мг/мл. Однако его эффективность для белков, существенно различающихся по содержанию ароматических аминокислот, неодинакова. Кроме того, на правильность результатов определения по Лоури оказывают заметное влияние многие примеси, например, нуклеиновые кислоты.

Для быстрых предварительных и сравнительных оценок может быть полезным определение белка по поглощению ультрафиолетового света при λ = 280 ммк, обусловленному входящими в его состав ароматическими аминокислотами. Чувствительность его довольно велика — около 0,2 мг/мл. Однако в присутствии нуклеиновых кислот результаты существенно искажаются. Частично скорректировать эти искажения можно, определяя поглощение не только при 280, но и при 260 ммк — в области максимального поглощения света нуклеиновыми кислотами. Существуют специальные таблицы и формулы, позволяющие по этим данным оценить соотношения содержания белка и нуклеиновых кислот. Однако для точных количественных определений малоизученных белков этот метод не может быть рекомендован.

Мы рассмотрели только те методы количественного определения белка, которые могут быть особенно полезны для наблюдения за ходом выделения и очистки. Известно немало других, менее универсальных, методов, применяющихся для решения других задач. К ним относится, например, определение концентрации белков в сыворотке крови по удельному весу последней — метод весьма ценный для клинических анализов. Заслуживает особого упоминания и весьма чувствительный метод определения белка по поглощению ультрафиолетового света с λ = 200-:-220 ммк (область поглощения пептидными группами белка). Его распространение сдерживается пока крайней дефицитностью соответствующей аппаратуры.