Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Осмотическое давление растворов белков

Изучение осмотического давления белковых растворов применяется для определения молекулярного веса белков и исследования взаимодействия между ними.

Если два раствора разделены полупроницаемой мембраной, то при достижении равновесия активность любого компонента, способного проникать через мембрану, должна быть одной и той же по обе ее стороны. Удобной мерой активности для воды является давление пара.

Если по одну сторону мембраны имеются белки, неспособные проникать через нее, то равновесие не может установиться при одинаковом внешнем давлении по обе стороны мембраны. В то время как вода, в которую помещен осмометр, имеет нормальную величину давления пара, активность воды внутри осмометра уменьшается за счет гидратации белков. Следовательно, молекулы воды будут проходить через мембрану в направлении белкового раствора. Однако этому процессу можно противодействовать путем увеличения гидростатического давления на белковый раствор. Если приложенная разность давления достаточна для выравнивания активности веды (давления ее паров) по обе стороны мембраны, то равновесие восстанавливается. Давление, необходимое для достижения этого состояния, и называется осмотическим давлением.

Осмометр, в котором определяют осмотическое давление белка, состоит в основном из полупроницаемой мембраны, содержащей белковый раствор, и капилляра, служащего манометром. Если полупроницаемую мембрану, заполненную белком, поместить в воду, то вода начнет перемещаться в белковый раствор, и уровень в капилляре будет подниматься до тех пор, пока гидростатическое давление не станет равным осмотическому давлению белкового раствора.

Осмотическое давление весьма разбавленных растворов пропорционально молярной концентрации белка С и абсолютной температуре Т:

р = К∙С∙Т,       (4)

где К — константа. Если осмотическое давление выражено в атмосферах, то К тождественна газовой постоянной R = 0,082 л ∙ атм/град. Поскольку С = с/М, где с — концентрация белка (г/л), а М — его молекулярный вес, то

Это известное уравнение Вант-Гоффа для осмотического давления. Оно говорит о том, что «идеальное» осмотическое давление равно тому давлению, которое производило бы растворенное вещество, находясь в газообразном состоянии при той же молярной концентрации. Поскольку уравнение Вант-Гоффа справедливо только для очень разбавленных растворов, в которых концентрация белка приближается к нулю, его правильнее выражать следующим образом:

где отношение р к с является предельной величиной, которая может быть определена только соответствующей экстраполяцией. Однако это отношение даже при очень малых концентрациях белка часто существенно отличается от предельного отношения при нулевых концентрациях, т. е. экстраполяцией не всегда удается получить его правильное значение.

Для учета отклонений от идеальных условий в уравнение (5) необходимо ввести соответствующую поправку, тогда оно принимает следующий вид:

где В — постоянная для данной системы.

Если графически изобразить зависимость p/RT ∙ с от с, то тангенс угла наклона прямой даст нам множитель В, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, будет равен 1 /М. Константа В носит название константы взаимодействия, и ее величину можно рассматривать как меру «эффективного объема» молекул, т. е. размера области вокруг центра данной молекулы, в которую другие молекулы не могут проникнуть. У длинных молекул эффективный (занятый) объем молекулы оказывается намного больше фактического, и величина В приобретает большие положительные значения. Поэтому отклонение от идеального поведения особенно велико для нитевидных молекул. Очевидно, что определение молекулярного веса значительно упрощается, если не учитывается константа взаимодействия и концентрация белка очень низка. В этом случае осмотическое давление определяется путем построения графической зависимости р от с и экстраполяции кривой до с = 0; отрезок, отсекаемый на оси ординат, рассматривается как осмотическое давление идеального раствора и используется для расчета М согласно уравнениям (5) и (6).

На осмотическое давление растворов белка оказывает влияние pH раствора, поскольку число заряженных групп в белковой молекуле зависит от pH. В зависимости от pH раствора белок может находиться преимущественно в виде поликатионов или полианионов, в связи с чем для уравновешивания заряда белковых ионов необходимо проникновение через мембрану некоторого количества диализующихся ионов обратного знака. Это ведет к неравномерному распределению диализующихся ионов с внешней и внутренней сторон мембраны (эффект Доннана) и к увеличению величины р за счет возрастания суммарной молярной концентрации частиц с внутренней стороны мембраны. Следовательно, величину осмотического давления белка следует измерять вблизи его изоэлектрической точки, когда число заряженных групп сбалансировано. Для уменьшения эффекта Доннана и исключения ошибки, вызываемой проникновением солей в раствор белка, в качестве растворителя обычно используют солевые растворы; в них же погружают и мембрану осмометра.

Найденные таким путем молекулярные веса яичного и сывороточного альбумина и гемоглобина оказались равными соответственно 45, 69 и 72 тысячам, что хорошо совпадает с данными, получаемыми другими методами. К сожалению, осмометрические методы не дают возможности судить, является ли белок в растворе гомогенным, или же он представляет смесь белков различных молекулярных весов. В последнем случае мы получаем, как уже упоминалось, так называемое среднечисленное значение молекулярного веса. Кроме того, определение молекулярного веса по осмотическому давлению малопригодно для белков с относительно высоким молекулярным весом (порядка сотен тысяч и миллионов).