Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Скорость диффузии белков

Когда раствор белка находится в соприкосновении со свободным от белка растворителем, то происходит диффузия белковых частиц в растворитель. Скорость этого процесса можно выразить через количество белка, проходящее поверхность раздела в единицу времени, или, в дифференциальной форме, dm/dt. Очевидно, что скорость диффузии должна быть пропорциональна площади поверхности раздела А и градиенту концентрации белка в направлении диффузии dc/dx, т. е.

где D — коэффициент пропорциональности, называемый коэффициентом диффузии, который определяется особенностями данного белка и растворителя, а также температурой. Естественно, он тем выше, чем меньше размер молекул белка, вязкость растворителя η и чем больше температура Т. Для шарообразных молекул, размер которых характеризуется одним показателем — радиусом r, эта зависимость выражается формулой

где N — число Авогадро, a R — газовая постоянная. Коэффициент диффузии белков — величина порядка 10^-6—10^-7 см²∙сек^-1 а аминокислот — 10^-5 см²∙сек^-1. Поскольку молекулярный вес шарообразной частицы белка равен объему шара с радиусом r, помноженному на плотность частицы а и число Авогадро, то формула (9) может быть преобразована в следующую

Таким образом, зная коэффициент диффузии и плотность белковой частицы, можно определить ее молекулярный вес.

Вместе с тем полученные экспериментально значения коэффициента диффузии могут быть использованы и для определения формы молекулы — в частности, для расчета соотношения ее осей. Поскольку молекулы белка в большей своей части не являются шарообразными, они перемещаются при диффузии медленнее, чем шарообразная молекула того же молекулярного веса. В этом случае по формуле (9), подставив найденный экспериментально коэффициент диффузии, можно рассчитать «кажущийся» радиус r белковой частицы. С другой стороны, определив другими методами молекулярный вес данного белка, можно рассчитать r₀ — радиус идеальной шарообразной частицы с той же плотностью по формуле

Где — объем отдельной молекулы. Нешарообразную молекулу белка можно приближенно описать как эллипсоид вращения. Поэтому, установив отношение «кажущегося» радиуса к идеальному r/r₀, можно по специальным формулам рассчитать соотношение b/a, где b — экваториальная полуось эллипсоида и а — полуось вращения. Для вытянутых эллипсоидов b/а оказывается меньше 1, для сплющенных — больше 1.

Экспериментально постоянную диффузии определяют путем измерения скорости размывания четкой границы раздела, созданной в вертикальной кювете между белковым раствором и растворителем. Это измерение проводят путем регистрации изменения градиента показателя преломления с последующим расчетом градиента концентрации, поскольку они связаны линейной зависимостью.

Однако создать четкую границу раздела между двумя растворами очень трудно. Поэтому чаще оба раствора разделяют пористым диском, и скорость диффузии оценивается путем измерения количества белка, прошедшего через единицу площади за определенное время. Диффузионный сосудик калибруется при помощи раствора белка, коэффициент диффузии которого известен. Если молекулярный вес этого белка М₁ и коэффициент диффузии D₁, то молекулярный вес неизвестного белка М₂ можно определить по формуле

При равенстве «кажущихся» радиусов (r₁ и r₂) и плотности частиц (σ₁ и σ₂) формула значительно упрощается:

Молекулярные веса, рассчитанные из скоростей диффузии, дают величины того же порядка, что и значения, полученные другими методами. Правда, отклонения от шарообразной формы и гидратация молекул, сказывающиеся на скорости диффузии, приводят к тому, что этот метод редко используется для прямого расчета молекулярных весов. Чаще он сочетается с методом скорости седиментации.