Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Аналитическое ультрацентрифугирование
Метод седиментационного равновесия

Если ультрацентрифуга вращается достаточно долгое время со скоростью порядка 8000—15 000 об/мин, то скорость переноса веществ за счет седиментации будет мала и соизмерима со скоростью переноса за счет диффузии. В результате через определенный промежуток времени достигается равновесное распределение концентраций во всей ячейке. Скорость переноса растворенного белка через поверхность поперечного сечения А за счет центробежной силы равна с∙A∙dx/dt. Скорость диффузии через ту же поверхность по закону Фика составляет — D∙A∙dc/dx. Как следует из уравнения (35), скорость dx/dt равна центробежной силе, деленной на коэффициент трения (φ/f). Отсюда результативная скорость движения белка:

Так как f=kT/D, то

В момент равновесия перенос белка в любом месте ячейки равен нулю и dc/dx = φc/kТ. Подставляя значения φ из уравнения (34) и умножая числитель и знаменатель на число Авогадро, получаем

Перенеся члены уравнения, содержащие с, в его левую часть, а содержащие χ — в правую и проинтегрировав, получим

где с₂ и c₁ — концентрации, а х₂ и х₁ — расстояния от центра ротора до какой-либо пары точек внутри ячейки. Уравнение (45) является основным уравнением седиментационного равновесия.

Обычно опыты по седиментационному равновесию проводят при небольших скоростях вращения ротора, например при 8000 об/мин, что соответствует небольшой силе ускорения (порядка 5000 g). Поэтому на седиментационной диаграмме не происходит появления пика, а имеет место характерное распределение концентраций или градиентов концентраций (рис. 41). По указанным седиментационным диаграммам могут быть определены расстояния х₂ и x₁ и концентрации с₂ и c₁. Вместе с тем благодаря незначительной скорости центрифугирования для достижения седиментационного равновесия требуется очень длительное время центрифугирования, которое достигает нескольких суток. Помимо неудобств, возникающих от столь длительной работы ультрацентрифуги, имеется опасность денатурационных изменений нестойких белков в процессе опыта. Рекомендуется поэтому для ускорения достижения равновесия создавать в кювете градиент концентраций белка еще до центрифугирования, переслаивая растворы разных концентраций.

В результате, несмотря на то, что этот метод базируется на строгой теоретической основе, он используется значительно реже, нежели метод скорости седиментации. Для преодоления недостатков метода Арчибальдом были предложены теоретические расчеты для вычисления молекулярных весов по скорости приближения к седиментационному равновесию, не дожидаясь действительного равновесия. Предложенный им метод также связан с определенными экспериментальными трудностями и пока сравнительно редко применяется на практике.