Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Определение величины и формы белковых молекул
Сравнительная характеристика методов, применяемых для оценки величины и формы белковых молекул

Материалы настоящей главы показывают, что молекулярный вес и общую характеристику формы белковой частицы можно получить с помощью целого ряда методов. Если достаточно строго соблюдаются все условия их применения и учитываются особенности каждого метода, то они дают весьма близкие результаты (см. табл. 5). Сопоставляя описанные выше методы, следует, однако, признать, что наиболее надежные значения молекулярного веса получаются с помощью измерения скорости осаждения в ультрацентрифуге. При расчете фактически используются не только данные ультрацентрифугирования, но и величина коэффициента диффузии. Этот метод (или, точнее, сочетание

Рис. 41. Схематическое изображение седиментационных диаграмм для пяти последовательных моментов опыта по определению молекулярного веса методом полного седиментационного равновесия (Schachman, 1959):

а — кривые изменения концентрации, б — кривые изменения градиента концентрации; 1- 5 — кривые от начала опыта до дoстижения полного равновесия.

Таблица 5 Молекулярные веса некоторых белков, определенные различными методами

двух методов) выгоден тем, что одновременно дается и оценка гомогенности исследуемого препарата. Правда, она не является исчерпывающей, но все же существенно повышается уверенность исследователя в том, что найденное значение молекулярного веса относится к достаточно однородной фракции. В последнее время для определений молекулярного веса все чаще используются новые, наиболее практичные модификации метода седиментационного равновесия, позволяющие исследовать относительно низкомолекулярные белки, а также использовать относительно низкооборотные центрифуги. Однако в полной мере конкурировать с методом скорости осаждения этот метод, по-видимому, не сможет. Немало ценных данных о молекулярном весе получено и с помощью метода светорассеяния. Следует, однако, подчеркнуть относительно меньшую надежность этого метода и желательность проверки устанавливаемых с его помощью значений другими методами. Еще более осторожной оценки требуют результаты определений молекулярного веса с помощью осмометрии, вискозиметрии и по скорости диффузии (без сочетания с ультрацентрифугированием). Последние два метода имеют наибольшую ценность для общей оценки формы, точнее, степени диссимметрии белковой молекулы. Однако для этого необходимо, чтобы молекулярный вес был надежно установлен с помощью других методов, например, путем ультрацентрифугирования.

Не следует, однако, забывать, что ни один из описанных методов нельзя признать идеальным ни в отношении совершенно точного определения молекулярного веса, ни, особенно, в отношении оценки формы белковой молекулы. В действительности молекулы белка не являются ни шарообразными, ни эллипсоидальными, а имеют гораздо более сложные очертания, которые могут описываться указанными геометрическими фигурами лишь сугубо приближенно. Действительную величину и форму белковых частиц можно пока оценить лишь с помощью методов дифракции рентгеновых лучей и электронной микроскопии, принципы которых описаны в гл. V. Эти приемы, особенно рентгеноструктурный анализ, позволяют полностью раскрыть четвертичную и третичную структуру ряда белков. При этом общие данные о величине и форме молекул являются частным результатом. Однако для подавляющего большинства белков еще не скоро наступит время полного раскрытия их структуры, поскольку названные методы чрезвычайно сложны и трудоемки. Поэтому для характеристики величины и формы этих белков и необходимы методы, описанные в настоящей главе.