Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Выделение и очистка белков
Извлечение белков из клеток и тканей

Обычно уже на этой стадии белок не только извлекается, но и подвергается первичной очистке.

Если белок содержится в межклеточной жидкости, то иногда достаточно механического отжимания тканевого «сока». Однако внутриклеточные белки могут быть получены с хорошим выходом лишь после измельчения ткани. Во многих случаях достаточно измельчения посредством растирания в ступке и с помощью обычных мясорубок (в том числе так называемой мясорубки Латапи, обеспечивающей более тонкое измельчение небольших количеств ткани). Однако более эффективно, удобно и воспроизводимо измельчение с помощью специальных гомогенизаторов. Среди них следует различать гомогенизаторы, где измельчение суспензированных в жидкости кусочков ткани или грубого тканевого фарша производится быстровращающимися ножами, и гомогенизаторы, в которых измельчение происходит в результате растирания ткани между стеклянными или пластмассовыми поверхностями (зазор между последними может меняться в зависимости от требуемой степени измельчения). Гомогенизаторы первого типа производительнее, но оказывают на клетки относительно грубое воздействие. Второй тип гомогенизаторов позволяет, строго регулируя степень измельчения, выделять неповрежденными отдельные элементы клетки (например, ядра).

Нередко для полного разрушения клетки требуются значительные усилия. Здесь может быть полезным, кроме механического разрушения, такое воздействие, как чередующееся быстрое замораживание и оттаивание. Нередко хорошие результаты дает быстрое замораживание в жидком воздухе или азоте с последующим измельчением замороженного препарата в ступке или фарфоровой мельнице. Для особо прочных клеток (например, некоторых бактериальных), а также для глубокого разрушения отдельных элементов животной клетки (например, митохондрий) рекомендуется обработка ультразвуком. Варьируя мощность источника и частоту колебаний, можно, как правило, подобрать режим воздействия, при котором не происходит денатурации извлекаемого белка.

Многие относительно устойчивые белки можно успешно извлечь из тканевых препаратов после обработки их такими агентами, как ацетон или растворы глицерина. Наконец, извлечение облегчается, если тканевые препараты предварительно лиофилизованы.

Выбор состава экстрагента проводится обычно с таким расчетом, чтобы, наряду с наиболее полным извлечением выделяемого белка, отбросить (и даже коагулировать) примеси. Хорошие результаты дает, например, извлечение протеиназ из поджелудочной железы 0,25 н. серной кислотой или экстракция гистонов из ядер клеток смесью водного раствора соляной кислоты и этанола. Однако для менее стабильных белков столь грубые экстрагенты неприменимы, и требуется более тонкий подбор значений pH, ионной силы раствора, температуры, продолжительности извлечения и состава экстрагента.

Следует подчеркнуть, что, варьируя содержание и соотношение различных солей, необходимо ориентироваться не только на молярную концентрацию, но и, главным образом, на ионную силу раствора.

Ионная сила р равна половине суммы произведений концентраций С каждого присутствующего в растворе иона на квадрат его валентности (заряда) Z:

где индекс і — порядковый номер, присвоенный иону в данном растворе, содержащем всего n ионов.

Оперируя именно ионной силой раствора, можно наилучшим образом учесть суммарный эффект концентраций и зарядов всех ионов.

Наглядным примером сложного режима экстракции белка являются канальные стадии выделения миозина из мышечной ткани.

Лабильность этого белка требует проведения всех операций при 0:4° и pH, превышающем 6,5. Работа при таких температурах необходима также для сохранения в мышце и в мышечном гомогенате некоторого количества аденозинтрифосфорной кислоты, которая способствует диссоциации основного сопутствующего белка — актина — и повышает извлекаемость миозина. Выбор ионной силы определяется тем, что при μ=0,3 извлечение миозина протекает очень медленно, а при повышении ионной силы быстро возрастает доля сопутствующего актина. Обычно пользуются ионной силой, близкой к 0,5. Аналогичные осложнения возникают и при выборе оптимального значения pH. Быстрая и полная экстракция осуществляется при pH 7,5-:-8,0 Однако при этом очень велики примеси актина. Поэтому идут обычно на потерю части миозина ради большей его чистоты уже на этой стадии и пользуются значениями pH в интервале 6,7 -7,0. Не менее важное значение имеет продолжительность экстракции, которую ограничивают, как правило, 15—30 мин - опять-таки для снижения примеси актина.

Особенно трудной задачей является выделение труднорастворимых белков, например, склеропротеинов (белки покровных и соединительных тканей — кератин, фиброин шелка и др.). В этих случаях после удаления большей части растворимых белков пытаются использовать устойчивость склеропротеинов к действию пепсина или трипсина, разрушая с помощью последних остатки сопутствующих белков. Нередко исследователям приходится для изучения отдельных особенностей состава и структуры этих белков заведомо идти на их растворение в условиях, когда происходит частичная фрагментация белка (в растворах щелочей, мочевины, бромистого лития, восстановителей, расщепляющих дисульфидные связи, и т. и.).