Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Выделение и очистка белков
Разделение белковых смесей
Методы, основанные на различиях в растворимости белков

В большинстве случаев уже при извлечении белка из ткани происходит некоторая его очистка. Однако первичный экстракт всегда является сложной смесью белков, полное разделение которых требует сочетания различных методов. Рассмотрим главные из них.

В предыдущем разделе было показано, что различия в растворимости белков позволяют добиться некоторой очистки их уже па стадии извлечения из клеток и тканей. На этом же принципе основан ряд методов дальнейшего фракционирования и очистки. Пользуясь различными сочетаниями таких факторов, как концентрация солей, диэлектрическая постоянная и рII среды, можно добиться весьма эффективного разделения близких по свойствам белков.

Высаливание. Классический метод разделения альбуминов и глобулинов сыворотки крови основан на осаждении последних 2 М сульфатом аммония (50%-ное насыщение). Альбумины осаждаются лишь 4 М сульфатом аммония (100%-ноe насыщение). Вместо сульфата аммония могут быть использованы и другие нейтральные соли — сульфат натрия, сульфат магния, смеси одно- и двухзамещенных фосфатов и др. Однако наибольшее распространение в качестве солевого осадителя белков получил именно сульфат аммония. Это обусловлено главным образом тем, что высокая растворимость в воде сочетается у него с практической независимостью растворимости от температуры. Так, концентрация насыщенного раствора сульфата аммония при переходе от 25 к 0° снижается лишь с 4,1 до 3,9 М. Напротив, такие оcадители, как, например, сульфат натрия, имеют ограниченную область применения из-за низкой растворимости при температуре, близкой к 0°. Сульфат аммония весьма удобен также тем, что не оказывает денатурирующего воздействия на самые лабильные из известных белков.

При строго контролируемых значениях температуры, продолжительности осаждения и pH с помощью сульфата аммония и других солевых осадителей можно добиться довольно тонкого разделения. Так, например, ступенчатое изменение концентраций сернокислого аммония от 0 до 1,34 М, далее до 1,64 М и, наконец, до 2,05 М позволяет фракционировать глобулин сыворотки на альфа-, бета-, и гамма-глобулины соответственно. Все отмеченные достоинства сульфата аммония и поныне широко используются многими исследователями на начальных стадиях очистки ряда белков, в особенности малоизученных и лабильных. Следует отметить, однако, общий недостаток всех солевых осадителей — трудность их удаления из полученного препарата. Для этого приходится прибегать либо к длительному диализу, либо к переосаждению другими методами.

Разделение белков при низких значениях ионной силы. Избирательное осаждение некоторых белков возможно и при сравнительно невысоких значениях ионной силы. В частности, белки мышц — актомиозин и миозин — осаждаются при разведении тканевых экстрактов водой до ионной силы 0,1—0,3 и 0,05—0,1 соответственно. Процедура очистки миозина, предложенная Моммeртсом и Пэрришем, является весьма показательным примером использования различных значений ионной силы для эффективного удаления примесей. Экстракт из мышечного фарша, полученный при ионной силе 0,5, диализируют против воды до μ = 0,05. Выпадающий при этом осадок, содержащий миозин и актомиозин, вновь растворяют при μ = 0,5, после чего ионную силу снижают разведением водой до 0,28. Пpиn этом выпадает осадок актомиозина, а миозин, свободный от актина, остается в растворе. Дальнейшим разведением водой ионную силу снижают до 0,05, в результате чего образуется осадок высоко очищенного миозина.

Классическим примером разделения белков при низких значениях ионной силы является также разделение глобулинов на фракции псевдо- и эйоглобулинов. Последние нерастворимы в бессолевых водных растворах и выпадают в осадок при диализе против воды.

Изоэлектрическое осаждение. Во многих методах очистки так или иначе используется снижение растворимости белков при pH, близком к значению изоэлектрической точки. Так, например, завершающий этап метода очистки по Штраубу одного из мышечных белков — актина — состоит в доведении pH водного экстракта до 4,7, т. е. до значения изоэлектрической точки актина. Этого оказывается достаточно для полного выпадения в осадок актина, практически свободного от примесей. Ряд белков в кристаллическом состоянии, в том числе сывороточный и яичный альбумин, получают, постепенно повышая концентрацию солей в белковых растворах, приведенных к изоточке.

Следует, однако, еще раз обратить внимание на то обстоятельство, что некоторые белки (миозин, например) склонны к денатурации вблизи изоэлектрической точки.

Известны случаи относительно избирательного осаждения ряда белков при значениях pH, довольно далеких от изоточки, но обеспечивающих образование нерастворимых комплексов с некоторыми биополимерами, присутствующими в смеси. Так, первичная очистка ряда бактериальных токсинов и анатоксинов (дифтерийного, ботулинического, столбнячного) достигается осаждением при pH 3,5:4,0— промежуточном по отношению к изоэлектрическим точкам этих белков и нуклеиновых кислот, содержащихся в культуральной жидкости. В этих условиях молекулы указанных белков и нуклеиновых кислот обладают противоположными зарядами и легко образуют нерастворимые соединения.

Действие солей и концентрации водородных ионов на растворимость белков может быть истолковано как результат влияния этих факторов на взаимодействие заряженных полярных группировок белковой молекулы друг с другом и с молекулами воды, а также на взаимодействие целых белковых молекул. В процессе высаливания происходит интенсивное связывание ионами солей дипольных молекул воды, в результате чего нарушаются «оболочки» из молекул воды, окружающие заряженные группировки белка и стабилизирующие молекулы белка в водных растворах. Известное значение может иметь и обратимое связывание заряженными группировками ионов солей. Все это согласуется с большим влиянием на растворимость белков поливалентных ионов.

Очевидно, что снижение растворимости белков вблизи изоэлектрической точки связано с минимальным значением суммарного заряда белковой молекулы в этих условиях и, следовательно, с понижением электростатических сил, препятствующих ассоциации одноименно заряженных молекул белка.

Значительное влияние на силы электростатического взаимодействия заряженных групп белковой молекулы оказывает также диэлектрическая постоянная среды. Вода обладает высокой диэлектрической постоянной. Поэтому все агенты, существенно снижающие диэлектрическую постоянную, являются эффективными осадителями белков. К таким агентах! относится ряд органических растворителей, смешивающихся с водой.

Фракционирование с помощью органических растворителей. Обычно для фракционирования белков используются такие органические растворители, как этанол и ацетон. Поскольку они обладают денатурирующим воздействием на многие белки, важными условиями их применения являются, во-первых, работа при низких температурах (—5-:- —10°) и, во-вторых, строгое ограничение продолжительности воздействия. Выполнение последнего условия облегчается тем, что, в отличие от солевых осадителей, органические растворители можно быстро и полно удалить из белковых препаратов высушиванием из замороженного состояния. Эффективное фракционирование с помощью органических растворителей обеспечивается не только достижением определенных концентраций этих агентов, но и подбором сочетаний ионной силы, pH и температур, оптимальных для выделения каждой фракции.

Широко распространенным методом этого типа является фракционирование белков плазмы крови по Кону. Высокая эффективность, воспроизводимость и практичность этого метода позволяют использовать его не только в условиях лаборатории, но и для промышленного получения высокоочищенных препаратов белков плазмы крови. Однако схема очистки по этому методу сложна, и описание ее выходит за рамки настоящего Руководства. Примером более простого метода, в котором используются органические растворители, является фракционирование основных белков ядер — гистонов — из ткани тимуса по Джонсу. Гомогенат ткани экстрагируют смесью 4 объемов этанола и 1 объема 1,25 н. соляной кислоты. Из экстракта Диализом против абсолютного этанола осаждают фракцию гистонов, очень богатую аргинином. Одновременно из экстракта удаляют большую часть соляной кислоты. Оставшиеся в растворе гистоны, умеренно богатые аргинином, осаждают добавлением 3 объемов ацетона. Далее из остатка тканевого гомогената производят дополнительное извлечение 0,25 н. раствором соляной кислоты гистонов, богатых лизином. В свою очередь из него осаждают ацетоном в возрастающих концентрациях гистоны, очень богатые лизином (75% ацетона по объему), и гистоны, умеренно богатые лизином (83% ацетона по объему). Все осадки гистонов, получаемых по этому методу, промывают ацетоном для удаления примесей воды и этанола, после чего ацетон легко удаляется высушиванием под вакуумом.

Избирательное осаждение белков другими реагентами.

В особых случаях при очистке белков могут быть полезны такие энергичные осадители, как метафосфорная кислота, соли некоторых тяжелых металлов, трихлоруксусная кислота и ряд других. Очевидно, что использование осадителей такого типа, известных как денатурирующие агенты, возможно лишь при очистке белков, особо устойчивых к денатурации, или требует отработки весьма строгих условий, позволяющих защитить белки от денатурации. В то же время возможности использования относительно малых концентраций таких реагентов и большая полнота осаждения привлекают к ним внимание при разработке промышленных схем получения некоторых белков. Так, весьма эффективным и практичным оказался метод первичной очистки бактериальных анатоксинов осаждением метафосфорной кислотой в малых концентрациях. Один из вариантов метода выделения богатых лизином гистонов предусматривает их осаждение трихлоруксусной кислотой, причем в этом случае заведомо денатурируется ряд сопутствующих белков. Чрезвычайно высокая устойчивость к денатурации таких энзимов, как, например, аргиназа и гиалуронидаза, позволяет использовать для избирательного осаждения их сульфаты марганца и меди. Наконец, в условиях строгого контроля температуры, pH, а также при быстром и полном удалении осадителя специальными реагентами возможно использование солей свинца, кадмия, меди и ртути даже для фракционирования белков сыворотки. Естественно, однако, что методы этого типа не получили сколько-нибудь широкого распространения применительно к очистке сывороточных белков в силу существования более щадящих и лучше воспроизводимых методов.

Кристаллизация белков. Многие белки можно получить в кристаллическом состоянии. Для этого необходимо предварительно очистить белок, подлежащий кристаллизации, настолько, чтобы он был заведомо преобладающим компонентом в маточном растворе. Сам процесс кристаллизации сводится обычно к следующему. Готовят раствор белка в концентрации, близкой к насыщению в данном растворителе. Постепенно вводят тот или иной осадитель, чтобы снизить растворимость белка до уровня насыщения или небольшого перенасыщения. В качестве осадителей при кристаллизации используют, как правило, нейтральные соли — сульфат аммония, сульфат магния и др. — или органические растворители — этанол, ацетон. Постепенность введения осаждающего агента является важным условием успеха. Это может быть достигнуто, например, диализом маточного раствора против раствора с избыточной концентрацией осадителя. Затем следует длительное, иногда многосуточное, выдерживание раствора; при этом происходит постепенное образование и рост кристаллов. Размер кристаллов обычно невелик — их приходится наблюдать под микроскопом при малом увеличении. Кристаллизация значительно ускоряется при внесении затравки — небольшого количества кристаллов того же белка. Так были получены кристаллические препараты яичного и сывороточного альбумина, гемоглобина, миоглобина, трипсина, химотрипсина к многих других. Микрофотографии некоторых кристаллических белков представлены на рис. 1.

Кристаллизация, а также многократная перекристаллизация являются хорошими методами дополнительной очистки белка на заключительных этапах выделения. Не следует, однако, полагать, что получение белка в кристаллическом состоянии свидетельствует о достижении наивысшей степени очистки — гомогенности белка. Известно немало случаев, когда кристаллические препараты белка содержат некоторое (обычно небольшое) количество примесей. Следует также иметь в виду, что многие белки пока не поддаются кристаллизации.