Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Денатурация белков
Свойства денатурированных белков

Поскольку денатурация представляет собой внутримолекулярную перестройку структуры белка, то ее можно определить и исследовать путем изучения физических, химических или биологических изменений последнего. К наиболее важным изменениям, которые происходят при денатурации белка и могут быть измерены количественно, относятся: 1) увеличение реактивности химически активных групп, входящих в состав молекулы, 2) уменьшение растворимости белка, 3) изменение формы или величины молекулы, 4) большая доступность воздействию протеолитических энзимов и 5) утрата биологической активности. Рассмотрим эти изменения более подробно.

Увеличение реакционной способности денатурированных белков впервые было обнаружено еще в 1911 г. Арнольдом. Ему удалось показать, что при тепловой коагуляции яичного белка появляются группировки, которые дают положительную нитропруссидную окраску. Впоследствии эти тиоловые группировки получили название «скрытых» или замаскированных. При оценке количества таких сульфгидрильных групп в различных белках исследователям пришлось столкнуться с рядом трудностей, которые были обусловлены несколькими причинами. Одна из них заключалась в том, что нативные белки содержат тиоловые остатки нескольких типов. К первому из них относятся сульфгидрильные группы, расположенные, вероятно, на поверхности белковых частиц и потому легко реагирующие с нитропруссидом, окислителями (феррицианид, тиоцианат), n-хлормеркурибензоатом и йодацетамидом. Эти группировки называются свободно реагирующими SH-группами. Ко второму типу тиоловых остатков относятся медленно реагирующие SH-группы, которые вступают во взаимодействие только с n-хлормеркурибензоатом. И, наконец, замаскированные SH-группы реагируют со всеми реагентами только после денатурации белка. При этом в различных нативных белках могут содержаться SH-группы с различной степенью реактивности. Например, нуклеопротеиды печени содержат только свободно реагирующие SН-группы, серумальбумин — только скрытые, а миозин — тиоловые группы обоих типов. Поэтому число определяемых SН-групп будет зависеть как от природы белка, так и от метода определения.

Вместе с тем число определяемых групп зависит и от природы денатурирующего агента. Так, при тепловой денатурации яичного альбумина в коагулированном белке удается определить только половину SH-гpyпп, тогда как мочевина и солянокислый гуанидин освобождают соответственно 80 и 100% тиоловых групп. Следовательно, для оценки количества «скрытых» SH-групп необходимо правильно подобрать метод определения и тип денатурирующего агента. Тем не менее в результате этих многочисленных исследований удалось не только доказать, что в денатурированном белке обнаруживается больше сульфгидрильных групп по сравнению с нативным, но и оценить количество замаскированных групп для ряда белков. Аналогичные данные были получены и для дисульфидных групп белков.

Наряду с сульфгидрильными и дисульфидными группами при денатурации белков наблюдается увеличение реактивности и других химически активных групп. Так, в нативном яичном альбумине с динитрофторбензолом реагируют 3 ε-аминогруппы лизина, тогда как при денатурации число таких групп увеличивается до 9. В случае ß-лактоглобулина было найдено, что все 31 ε-аминогруппы лизина ацетилируются кетеном, но лишь 19 реагируют с динитрофторбензолом. При денатурации нагреванием, спиртом и солянокислым гуанидином все ε-аминогруппы становятся реактивными. Тот факт, что все ε-аминогруппы могут апетилироваться и что только некоторые из них реагируют с динитрофторбензолом, указывает на экранирование части этих групп складками полипептидных цепей.

Точно так же при денатурации увеличивается число связываемых динитрофенолом гистидиновых групп, равно как и число обнаруживаемых ß- и у-карбоксильных групп. Так, после денатурации ß-лактоглобулина количество реактивных гистидиновых остатков возрастает с двух до четырех, в случае карбоксигемоглобина освобождаются 36 карбоксильных групп на одну молекулу белка. Увеличивается и интенсивность цветных реакций на тирозин с фосфорномолибденовой кислотой или диазореагентами и на аргинин при обработке реактивом Сакагучи.

Все изложенные факты более высокой реакционной способности денатурированных белков показывают, что часть активных функциональных групп в нативном белке «скрыта» внутри молекулы. По-видимому, эти группы могут быть экранированы складками полипептидных цепей или становятся недоступными в результате образования внутримолекулярных водородных, электростатических и, возможно, легко диссоциируемых ковалентных связей (см. гл. V). Весьма вероятно также, что экранизация обусловлена и близким присутствием других групп, могущих связывать или отталкивать молекулы реагента. Увеличение числа реакционноспособных групп указывает на то, что в процессе денатурации происходят разрыв вторичных связей и разворачивание полипептидных цепей.

Изменения числа реактивных групп при денатурации проявляются и в изменении изоэлектрической точки белков. Как правило, изоэлектрическая точка смещается в сторону щелочных значений pH.

На изменение расположения пептидных цепей в ходе денатурации указывает изменение ряда физико-химических свойств белковой молекулы. Одним из таких показателей является уменьшение растворимости, хотя способность белков к гидратации изменяется незначительно. Уменьшение растворимости белка, вероятно, зависит от появления на поверхности частицы значительного числа гидрофобных, ранее экранированных групп и образования большого числа электростатических межмолекулярных связей.

Изменяются и молекулярно-кинетические свойства белков, зависящие от величины и формы их частиц. При денатурации таких белков, как сывороточный альбумин и глобулин, яичный альбумин и ß-лактоглобулин, под действием различных денатурирующих факторов — крайние значения pH, обработка мочевиной и др. — сильно увеличивается удельная вязкость, наблюдается увеличение коэффициента диссимметрии и величины двойного личепреломления в потоке, а также уменьшение константы диффузии. Все это служит указанием на то, что при денатурации глобулярных белков происходит увеличение асимметрии белковой молекулы, обусловленное переходом от упорядоченной компактной глобулы к беспорядочному клубку.

При денатурации некоторых белков происходит не только изменение формы молекулы, но и диссоциация ее па более мелкие единицы. Изучение седиментационных характеристик и диффузии белков показало, что многие из них диссоциируют в 6—8 М растворах мочевины и при образовании мономолекулярних пленок. Так, миоген и гемоглобин распадаются на две субъединицы, а глобулины семян и эдестин — на шесть. Этими же методами было показано, что многие белки при нагревании подвергаются агрегации (например, яичный альбумин и ß-лактоглобулин). Таким образом, при денатурации могут осуществляться различные процессы (изменение формы, диссоциация и агрегация молекул). При этом характер денатурационных изменений будет зависеть не только от природы белка, но и от способа воздействия на него. Так, если яичный альбумин при обработке 6 М мочевиной претерпевает изменение формы молекулы, то при нагревании он подвергается агрегации.

Существенно изменяются и оптические характеристики белковой молекулы. Как уже упоминалось ранее, денатурация сопровождается увеличением отрицательной оптической активности, которое связано с разрушением а-спиральной конформации. В связи с увеличением асимметрии молекулы возрастает светорассеяние, а разрушение большого числа водородных связей изменяет характеристические частоты валентных колебаний в группах NH и СО и сдвигает максимумы поглощения этих групп в сторону более высоких частот инфракрасного спектра.

Изменение расположения пептидных цепей, превращение компактной молекулы в беспорядочный клубок, происходящее при денатурации, приводят к тому, что большинство пептидных связей становится доступным действию протеолитических ферментов. Благодаря этому скорость протеолиза денатурированных белков во много раз больше, чем у нативного белка. Последняя особенность также является характерным признаком денатурации и свидетельством развертывания пептидных цепей.

Наконец, при денатурации происходит утрата белками биологической активности. Воздействие денатурирующих агентов приводит к инактивации ферментов, гормонов и вирусов. Эта потеря специфических биологических свойств считается важным критерием денатурации. Однако имеется и ряд исключений. Например, активность инсулина сохраняется при денатурации мочевиной, в растворах которой сохраняют свою активность также трипсин, папаин и пепсин; рибонуклеаза и лизоцим обладают тепловой устойчивостью, и их активность слабо изменяется при кипячении в разбавленной кислоте. Наряду с потерей ферментативной активности наблюдается и изменение иммунологических свойств. Как известно, иммунологическая активность белков характеризуется двумя показателями — антигенностью, т. е. способностью возбуждать образование антител, и специфичностью. Исследование этих показателей привело к выводу, что при денатурации ряда белков происходит понижение антигенности, но сохраняется иммунологическая специфичность.