Химия белка - Часть 1 - Общая химия белка - Ашмарин И. П 1968

Денатурация белков
Термодинамика и кинетика денатурации

Термодинамика процесса денатурации довольно своеобразна. Происходящее при денатурации нарушение различных связей, определяющих конформацию полипептидных цепочек, приводит к большей их подвижности. Возрастает число возможных вариантов формы и расположения полипептидных цепочек в пространстве. Пользуясь терминологией статистической термодинамики, можно сказать, что возрастает число возможных микросостояний системы и, следовательно, увеличивается вероятность системы. Как известно, это выражается возрастанием энтропии. Сейчас можно считать установленным, что именно значительное возрастание энтропии является «термодинамическим двигателем» процесса денатурации. Для некоторых случаев денатурации величину изменения энтропии удалось рассчитать. Например, обратимая реакция денатурации трипсина сопровождается возрастанием энтропии на 213 кал/моль∙град. Это при температуре 50° изменяет энергосодержание системы на 68 870 кал/моль — величину относительно большую.

Ведущая роль возрастания энтропии подчеркивается еще и тем фактом, что денатурация протекает с довольно значительным поглощением тепла — вообще порядка 10 000— 100 000 кал/моль, а для рассмотренного выше примера денатурации трипсина — около 67 600 кал/моль (при 50°). Таким образом, необходимое для протекания реакции денатурации изменение свободной энергии системы достигается за счет преобладания энергии, освобождающейся благодаря возрастанию энтропии, над энергией, связываемой за счет поглощения тепла (68 870—67 600 = 1270 кал/моль).

Полезным является сопоставление термодинамических процессов, происходящих при денатурации и при плавлении льда. И тот, и другой процессы являются эндотермическими — система поглощает тепло. В обоих случаях процесс осуществляется в конечном счете благодаря значительному возрастанию энтропии. Наконец, процесс нарушения связей между молекулами воды в кристаллической решетке льда аналогичен процессам разрушения водородных связей и связей между гидрофобными группами, которые стабилизируют нативную структуру белковой молекулы. Следует отметить, что количество тепла, связываемого денатурирующимся белком, сопоставимо по порядку величин с суммарной энергией водородных связей белковой молекулы. Разумеется, полного совпадения здесь и не должно быть, так как водородные связи не являются единственным видом связей, поддерживающих конформацию полипептидных цепочек.

Кинетика денатурации белков также весьма своеобразна. Как правило, денатурация может быть охарактеризована как реакция первого порядка. Однако в отличие от большинства известных реакций первого порядка денатурация характеризуется очень высоким температурным коэффициентом. Обычно возрастание скорости реакции при повышении температуры на 10° является 2 -3-кратным. При денатурации наблюдается ускорение в 100 и более раз. Это соответствует очень высоким энергиям активации реакции денатурации — порядка 40 000 — 1 000 000 кал/моль. При столь высокой энергии активации можно было бы ожидать, по аналогии с многими другими реакциями, очень малой абсолютной скорости денатурации белков при температурах 30-100°. Однако это находится в резком противоречии с опытом, показывающим, например, что при 65° денатурация протекает, как правило, столь стремительно, что измерить ее скорость практически невозможно. Видимо, и эта особенность процесса денатурации объясняется очень значительным изменением энтропии уже при образовании активированной нестабильной молекулы белка, предшествующей денатурированной. Уже на этой стадии процесса идет интенсивное «плавление» водородных и иных связей с освобождением полипептидных цепочек и повышением числа возможных микросостояний системы.

Рассматривая динамику процесса денатурации, следует отметить крайнюю трудность выявления состояний белка, промежуточных между нативным и полностью денатурированным. Так, Б. А. Белицер и ряд других исследователей отметили скачкообразность проявления целого ряда признаков денатурации белка. Создается впечатление, что белок денатурируется, так сказать, по принципу «все или ничего». Возможно, наличие столь резких переходов объясняется кооперативным характером «плавления» водородных связей, определяющих конформацию полипептидных цепочек, — явление, всесторонне исследованное С. Е. Бреслером.

В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации — например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации — это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее «жестко», чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связен, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование.