Химия белка - Часть 2 - Избранные разделы частной химии белка - Ашмарин И. П 1968

Гистоны
Гетерогенность гистоновых фракций

Итак, данные химического фракционирования и результаты ионообменной хроматографии показывают, что суммарный гистон тимуса теленка (или других тканей) сострит по меньшей мере из 5—6 основных, легко различимых компонентов, большинство из которых можно разделить на несколько субфракций (см. табл. 8). Уже то, что фракции, получаемые одним методом, часто подразделяются на две или более субфракций другим, говорит об их гетерогенности. Сопоставление результатов определений аминокислотного состава, N-концевых групп и молекулярного веса отдельных фракций подтверждает это заключение (табл. 9).

Таблица 8 Основные классы гистонов и их фракционный состав, выявляемый различными приемами разделения

Таблица 9 Содержание N-концевых аминокислот во фракциях гистонов тимуса теленка (в % от всех N-концевых групп) (Johns, 1964; Butler, 1964)

Очевидно, что основные фракции гистонов далеко не гомогенны, даже если считать, что один тип N-концевой аминокислоты соответствует одному типу белка. Между тем некоторые фракции гистонов содержат в своем составе несколько разнотипных белков, имеющих одинаковые N-концевые группы. Так, например, во фракции f2b обнаружены два N-концевых пептида, которые резко отличаются по аминокислотному составу*, но имеют одинаковую N-концевую аминокислоту — пролин. Последнее говорит о том, что указанные пептиды относятся к двум различным белкам и что гомогенность препарата, установленная по N-концевой группе, часто не может считаться достоверной.

В качестве другого примера можно привести фракцию лизинбогатых гистонов Iа. Суммарное содержание в ней лизина и аргинина равно 28 мол. %. Следовательно, молекула этого белка должна содержать 29 чувствительных к трипсину связей и давать при гидролизе 30 пептидов. В действительности же в гидролизате было выявлено 68 пептидов. Очевидно, фракция Iа состоит по меньшей мере из двух полипептидных цепей, которые хотя и имеют одинаковые N-концевые группы, но отличаются по аминокислотному составу.

* Строение этих пептидов таково: 1) —Про—(Ала, Глю, Про)—Лиз; 2) —Про—(Аси, Глю, Гис, Илей, Сер2, Тре, Вал) — Лиз

Оценка гомогенности гистонов этими методами, а также приемами ионообменной хроматографии, электрофореза и противоточного распределения не только доказали гетерогенность основных фракций, но и позволили обнаружить их перекрестное загрязнение. Так было показано, что фракция лизинбогатых гистонов содержит примеси относительно богатых лизином и аргининбогатых гистонов, а фракция аргининбогатых гистонов — примесь гистонов, относительно богатых лизином. Все это значительно затрудняет изучение первичной структуры гистонов, а также оценку их физико-химических и биологических свойств.

Анализ аминокислотного состава, N-концевых аминокислот и определение молекулярного веса, хотя и говорят о гетерогенности выделяемых фракций гистонов, не позволяют определить их общее число. Приблизиться к ответу на этот вопрос можно, изучая картины электрофоретического разделения в крахмальном и полиакриламидном гелях.

Впервые метод электрофореза в крахмальном геле был применен к гистонам в 1959 г Нилином и Конеллом, которые сумели выявить около 16 субфракций для гистонов эритроцитов цыпленка и 18 — для тимуса теленка. Ряд из этих субфракций явился результатом агрегации гистонов, так как электрофорез проводился при pH 4,1—4,9. Для предотвращения агрегации Джонс, Филлипс и сотр. стали проводить электрофорез при pH 2,3 в геле, приготовленном на 0,01 н. соляной кислоте В этих условиях гистоны тимуса теленка разделялись па 10 субфракций, которые распадались по электрофоретической подвижности на три группы группу E₁, содержащую 5 полос, группу Е₂, содержащую 3 полосы, и группу Е₃, обладающую наименьшей электрофоретической подвижностью и содержащую две полосы По аминокислотному составу группа E1 соответствовала гистонам, относительно богатым лизином, а группы Е₂ и Е₃ — лизинбогатым и аргининбогатым гистонам соответственно (см табл. 8).

Еще больший эффект был достигнут путем сочетания методов электрофореза в крахмальном геле с химическим или хроматографическим фракционированием. Этим приемом удалось выявить дополнительные электрофоретические зоны, которые вследствие близких подвижностей маскировались на электрофореграммах тотальных гистонов. При этом наряду с основными зонами на электрофореграммах отдельных фракций гистонов выявлялись тонкие полосы, число которых увеличивалось при увеличении количества белка, вносимого в гель. Всего таким путем удалось выявить 8—10 основных и 6—10 минорных субфракций, т. е. около 16—20 отдельных компонентов.

Аналогичные результаты были достигнуты и электрофорезом в полиакриламидном геле. Уже в первых опытах этим приемом удалось разделить суммарные гистоны тимуса теленка сначала на 14, а затем и на 18 компонентов Число субфракций значительно возросло, когда в качестве исходного «сырья» стали брать не тотальные гистоны, а их основные фракции и когда для каждой фракции были найдены свои оптимальные концентрации и режимы разделения Так, например, лизинбогатые гистоны и гистоны фракции f2b удалось подразделить на 9 и 5 отдельных субфракций, а общее число выявленных зон достигло порядка 30. И здесь наряду с крупными, основными субфракциями были обнаружены тонкие минорные зоны, число которых зависело от концентрации вносимого материала (рис 16)

Рис. 16 Схемы электрофореграмм отдельных фракции гистонов тимуса теленка в полиакриламидном геле (Ашмарин и др, 19о8)

I - f1 II - f2а III - f2b IV - f3

Таким образом, наряду с несколькими основными фракциями гистонов (8—10), которые составляют, вероятно, до 90% тотального гистона, исследователи выявили целый спектр различных минорных компонентов. В настоящее время еще неясно, являются ли они примесями негистонных белков, комплексы которых с гистонами распадаются при электрофорезе, продуктами энзиматической деградации или агрегации основных фракций, или же независимыми белками — гистонами.

Возможность существования таких комплексов доказана работами Боннера, Буша, Хнилицы и других авторов, которые обнаружили в составе гистонов негистонные белки, связанные с РНК или нуклеотидами (подробнее см § 7). Однако при электрофорезе эти белки не мигрировали с гистонами, так как не имели положительного заряда. Не удалось обнаружить на электрофореграмм ах сходных минорных полос и в том случае, когда основные фракции гистонов предварительно частично гидролизовались самыми различными протеиназами и энзиматическими экстрактами. Хроматографическая очистка основных фракций от сопутствующих примесей других фракций также не избавляла от всех минорных компонентов, хотя число их уменьшалось. Уменьшалось оно и при электрофорезе в 7 М мочевине. Это говорит о том, что значительная часть минорных компонентов является следствием перекрестного загрязнения основных фракций гистонов, а также результатом их частичной агрегации. Очевидно, окончательное решение этого вопроса может быть получено только путем выделения этих компонентов и тщательного анализа их первичной структуры.

Поэтому в настоящее время трудно назвать точное число индивидуальных гистонов. Однако можно допустить, что оно относительно невелико и составляет порядка 10—15. Такое число типов гистонов не представляется незначительным, если учесть, что для репрессии одного гена требуется не одна, а несколько молекул гистонов. В этом случае существование 10—15 типов индивидуальных гистонов позволяет осуществлять огромное число специфических комбинаций.