Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Скоростная жидкостная хроматография белков

Скоростная жидкостная хроматография белков (СЖХБ) получила широкое применение при исследовании биополимеров; рассмотрим основные достоинства этого метода [20].

Фирма Pharmacia разработала колонку с частицами размером 9,8 (±2%) мкм, устойчивыми в области 2<рН<12. Сорбент доступен в форме катионита и анионита, а также в виде носителя с поверхностью, модифицированной для проведения хроматофокусирования (колонки Mono Q, Mono S и Mono Р). Эти сорбенты обладают высокой емкостью, позволяют работать при больших скоростях потока (до 1 мл/мин), при умеренных давлениях (10—20 бар), создаваемых плунжерными насосами. Благодаря низким давлениям можно использовать стеклянные колонки. Химическая устойчивость носителей дает возможность применять широкий набор буферов, включая детергенты, хаотропные агенты (например, Gu∙HCl). Фирма Pharmacia разработала ряд буферов, с помощью которых можно добиться оптимального разделения в определенных диапазонах pH, без изменений pH, присущих обычной ионообменной хроматографии. Время разделения чрезвычайно мало (1—5 мин), потому что степень разделения зависит от времени разделения значительно меньше, чем в других ионообменных процессах. Данные о элюировании белков, полученные на обычных ионообменниках, можно переносить на эксперименты СЖХБ, и обычно это приводит к улучшению разделения. При отсутствии информации о свойствах белковой смеси, подлежащей фракционированию, проводят оптимизацию условий разделения, ставя несколько экспериментов по СЖХБ с использованием разных буферов; результаты этих экспериментов представляют в виде кривых элюирования. В периодических изданиях фирмы Pharmacia описаны широкие возможности потенциального применения колонок этой фирмы, предназначенных для СЖХБ. Принципиально возможно (но не рекомендуется самой фирмой) использовать эти колонки на обычных хроматографах, снабженных соответствующими соединениями и клапанами сброса давления, превышающего заданную величину. Последнее устройство необходимо для защиты стеклянных колонок от разрушения под действием больших давлений.

При работе па таких колонках в присутствии хлорид-ионов при экстремальных pH не следует использовать насосы, изготовленные из нержавеющей стали.

Хроматофокусирование с применением колонок MonoQ — это новый метод, который характеризуется высоким разрешением; он может оказать большое влияние на разработку схем разделения смесей белков. Большим достоинством метода является возможность использовать различия в заряженности белков при pH, близких к рІ этих же белков. Детальное описание принципиальных основ разделения по этому методу можно найти в литературе фирмы Pharmacia.