Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Синтез смол
Смолы на основе полистирола

Исходным материалом для синтеза модифицированных смол на основе полистирола служит сополимер стирола с 1% дивинилбензола (Biobeads S-XI, фирма Biorad). На рис. 12.1 приведены схемы синтеза некоторых смол.

Полимеры, предназначенные для твердофазного анализа последовательности, должны обладать двумя существенными особенностями:

1) функциональные группы полимера должны быть доступны для пептидов и реагентов;

2) смола должна быть химически и механически устойчива в условиях реакции Эдмана.

12.3.1.1. Способность к набуханию. Для определения степени набухаемости смолы измеряют высоту слоя смолы (в небольшой плоскодонной пробирке) до и через 1 ч после добавления растворителя [27]. Отношение объемов набухшей и сухой смолы (V_s/V_d) должно составлять по крайней мере 3:5 для того, чтобы реагенты могли проникать внутрь частиц гидрофобного полимера. После синтеза смол на основе полистирола следует сравнить их способность к набуханию со значениями, представленными в табл. 12.1. Шарики идеального носителя для анализа последовательности должны быть небольшими по размеру, иметь малый разброс по диаметру частиц, что существенно для упаковки хроматографической колонки; сохранять постоянный объем набухания и устойчивость ко всем реагентам и растворителям, используемым в процессе определения последовательности. Однако смолы, наиболее пригодные для анализа структуры полипептидов, сильно набухают в пиридине, ДМФА, 1,2-дихлороэтане, ТФУ. Поскольку эти смолы лишь частично удовлетворяют вышеуказанным идеальным требованиям и изменение их объема в процессе определения структуры ведет к закупорке колонки или же к неэффективному проникновению реагентов и растворителей в поры носителя, то перед заполнением колонки смолы «разбавляют» стеклянными шариками (30-кратиое «разбавление» по массе) (см. разд. 12.5.2).

РИС. 12.1. Синтез носителей на основе поперечно-сшитого полистирола. 1 — сшитый полистирол, 2 — нитрополистирол, 3 — аминополистирол, 4 — хлорометилированный полистирол, 5 — этилендиаминополистирол, 6 — триэтилентетраминополистирол, 7 — нитрохлорометилполистирол, 8 — аминоэтилендиаминополистирол. Метод получения соединений 3 и 8 описан в тексте. Синтез остальных носителей см. в работе [29].

12.3.1.2. Синтез аминополистирола. В исходную методику [28, 30] внесены некоторые изменения.

Синтез нитрополистирола. 5 г полистирола (Biobeads S-XI, minus 400 меш) тщательно промывают последовательно бензолом, хлороформом, диоксаном, метанолом, расходуя по 200 мл каждого растворителя; продолжительность каждой промывки

Таблица 12.1. Способность к набуханию смол на основе полистирола^a

^а Объем cyxoй (V_D) и набухшей смолы (V_S) и отношение V_S/V_D определяли по Ларсену [27J: после центрифугирования измеряли объем 100 мг смолы, обрабатывали се 2 мл каждого растворителя, перемешивали, выдерживали 60 мин при комнатной температуре, центрифугировали, измеряли объем набухания.

^б Синтез описан в разд. 12.3.1.2.

^в Синтез описан в разд. 12.3.1.3.

30 мин. Затем промывают метанолом на металлическом сите (60 мкм) для удаления больших частиц, сушат шарики в вакууме. Выход —4 г. В охлажденную до — 3°С дымящую (90%-ную) азотную кислоту (55 мл) небольшими порциями в течение 15 мин при перемешивании добавляют смолу, поддерживая температуру не выше — 3°С. Перемешивают смесь 1 ч при 0°С. Смесь выливают на 500 мл льда и собирают смолу на пористом стеклянном фильтре. Промывают попеременно диоксином (4 раза по 200 мл) и водой (4 раза по 200 мл), затем метанолом (2 раза по 200 мл). Просеивают через сито (60 мкм) для удаления крупных частиц смолы и высушивают нитрополистирол в вакууме. Выход 6—7 г.

Синтез аминополистирола. Перемешивают суспензию 6,3 г нитрополистирола в 115 мл ДМФА при 140°С (масляная баня). Медленно добавляют 48 г SnCl₂∙2H₂О в 40 мл ДМФА (экзотермическая реакция), затем выдерживают реакционную массу 30 мин при 140°С. Охлаждают смесь до 100°С и добавляют 41 мл концентрированной соляной кислоты. Термостатируют при 95 °С в течение 1 ч, собирают смолу на пористом стеклянном фильтре. Промывают 2 М НСl (2 раза по 200 мл), водой (2 раза по 200 мл), просеивают через сито (100 мкм) для отделения грубых частиц смолы. Повторяют промывку 2 М НСl и водой, затем смесью ДМФА — триэтиламин (3:1, 2 раза по 200 мл) до отсутствия ионов хлора в промывках. Продукт (смола темно-зеленого цвета) промывают водой и еще раз просеивают через сито (100 мкм). Промывают метанолом (2 раза по 200 мл) и вновь просеивают через сито (60 мкм). Желто-коричневую смолу сушат в вакууме при 60°С. Выход 5,5 г.

Хранение смолы. Аминополистирол при комнатной температуре сохраняет свои свойства и характеристики всего один месяц. Небольшие количества можно хранить под азотом в запаянных ампулах при —20°С. В таких условиях смола сохраняет свои свойства до одного года.

Способность к набуханию. Полимер легко набухает в ДМФА и ТФУ, хуже — в пиридине и метаноле (табл. 12.1).

12.3.1.3. Синтез триэтилентетраминополистирола (ТЭТА-полистирола), ТЭТА-полистирол получают по методике, описанной в работах [24, 30]. Промывают частицы хлорометилировапного полистирола (Biobeads S-XI) бензолом, хлороформом, диоксаном и метанолом; сушат в вакууме. Перемешивают 1 г свежеприготовленной смолы с 15 мл триэтилентетрамина (ТЭТА) в течение 30 мин при комнатной температуре, затем нагревают на масляной бане при 115 °С еще 90 мин. Собирают смолу на пористом стеклянном фильтре, тщательно промывают 20 мл триэтиламина в течение 30 мин при комнатной температуре, фильтруют. Промывают попеременно метанолом, водой (каждым растворителем 3 раза по 200 мл), промывают еще раз водой, центрифугируют. Кипятят смолу в 50 мл 1 М соляной кислоты в течение 2 ч для удаления следов несвязанного ТЭТА, фильтруют. Промывают водой, триэтиламином, водой, метанолом (каждым растворителем 2 раза по 1 мл). Сушат в вакууме в течение ночи. Выход — 1 г.

Хранить, как аминополистирол. По стабильности ТЭТА-полистирол уступает аминополистиролу. После нескольких месяцев хранения при использовании в реакции Эдмана возрастает фон загрязнений.

Способность к набуханию хорошая (табл. 12.1). Следует промывать смолу непосредственно перед использованием, для чего используют растворители: ДМФА (2 раза по 1 мл), метанол (2 раза по 1 мл), триэтиламин (15 мл в течение 20 мин), воду, метанол; сушат в вакууме.