Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Дисульфидные связи
Расщепление полипептидной цепи до коротких цистинсодержащих пептидов
Гидролиз после малеилирования и сукцинилирования

Встречаются случаи, когда белок сохраняет устойчивость к действию протеаз после денатурации с 8 М мочевиной, 6 М гуанидин-HCl, кипячения или выдерживания в кислой среде. Подход к анализу таких белков разработан в работе [5]. Хотя токсин B-IV (нейротоксин, селективный к ракообразным) оказался чрезвычайно устойчивым к протеолизу как в нативном, так и в денатурированном состоянии, его производные (малеил- и сукцинил-) были чувствительны к действию трипсина.

4.4.6.1. Сукцинилирование [9]. К 1%-ному раствору белка в 1,0 М Na-бикарбонатном буфере (pH 8,0) при 25 °С постепенно в течение 1 ч добавляют 0,8 части (по массе) янтарного ангидрида. pH 8,0 реакционной смеси поддерживают путем добавления 0,1 М NaOH. Через 1—2 ч реакционную смесь разбавляют 2,5 объема дистиллированной воды и диализуют в течение 12 ч. Модификацию некоторых белков вполне возможно проводить в более мягких условиях [22]. Затем модифицированный белок может быть инкубирован одновременно в присутствии трипсина, химотрипсина и термолизина при соотношении фермент : субстрат= 1 : 50. Условия инкубации: 0,1 М К-фосфатный буфер (pH 6,8), 40 °С. Спустя 4 ч раствор подкисляют до pH 3,0 и высушивают лиофильно.

4.4.6.2. Малеилирование [5]. С помощью частичного малеилирования устойчивому к протеолизу белку можно придать чувствительность к действию трипсина. Реакцию проводят при 10-кратном избытке малеинового ангидрида (на каждую аминогруппу) при pH 8,0 в течение 5 ч. Затем доводят pH смеси до 7,0 и инкубируют модифицированный белок с трипсином при 37 °С и при соотношении фермент : субстрат= 1 : 33. Реакцию останавливают путем подкисления до pH 3,0. Снятие защитных групп проводят при pH 3,5, 37 °С в течение 48 ч [7]. Смесь пептидов может быть подвергнута дальнейшему гидролизу трипсином или другими протеазами.

Следует отметить, что при модификации и гидролизе белок выдерживают в нейтральной или слабоосновной среде, т. е. в условиях, в принципе не исключающих дисульфидный обмен. Относительно малеилироваиия см. разд. 3.4.2.2.