Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Сохранение постоянства и изменчивость геномов
Генетический обмен и рекомбинация

Не менее важный, чем мутации, вклад в изменчивость привносят способы генетического обмена и следующие за ними рекомбинационные события. Генетический обмен характерен как для эукариот, так и для прокариот и может осуществляться в ходе различных процессов. Для эукариотических организ­мов изучены половой и парасексуальный процессы: в ходе первого происхо­дит слияние половых клеток с образованием диплоидной зиготы, которая в большинстве случаев подвергается мейотическому делению, сопровождаю­щемуся рекомбинацией между хромосомами. В парасуксуальном цикле происходят объединение и последующая рекомбинация генов на основе собы­тий, осуществляющихся в митозе без участия оплодотворения половым пу­тем.

Обмен генетической информацией у прокариот происходит in vivo в ходе конъюгации, трансдукции и трансформации, а в лабораторных условиях, кроме того, при слиянии протопластов.

Конъюгация — процесс генетического обмена, требующий физического контакта клеток. При этом перенос генов осуществляется из донорских бак­терий (содержат конъюгативные плазмиды) в реципиентные клетки (бесплазмидные) по специальному каналу — конъюгативному мостику. Этот процесс опосредуется генами, расположенными на плазмидах. Плазмиды представляют собой суперспирализованные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК небольшой величины (2—600 т. п. н.), способные к автоном­ной репликации. Клетки, содержащие плазмиды, могут приобретать новые признаки. Эти признаки используются для обозначения выявленных впервые плазмид: F-плазмиды (факторы фертильности, или половые факторы), ответ­ственные за донорские свойства бактерий; Col-плазмиды (факторы колициногенности) —опосредуют способность клеток синтезировать особый класс бактериоцинов — колицины; R-плазмиды (факторы резистентности) — обусло­вливают устойчивость бактерий к антибиотикам и др. Плазмиды характери­зуются рядом общих и специфических свойств. К общим свойствам плазмид можно отнести способность к автономной репликации, к конъюгативному переносу, к интеграции в нуклеоид (эписомы), несовместимость (неспособ­ность некоторых плазмид стабильно наследоваться одной и той же клеткой).

Специфические (индивидуальные) свойства характеризуют небольшие группы плазмид и придают клеткам разные фенотипические свойства: устой­чивость к антибиотикам, катионам, анионам, мутагенным факторам, бактериоцинам, бактериофагам; способность деградировать ксенобиотики; синтез антибиотиков, бактериоцинов, пигментов, инсектицидов, поверхностных ан­тигенов, токсинов, ферментов; использование в качестве источников углерода разных сахаров и аминокислот; индукцию опухолей у растений и др.

Трансдукция — способ генетического транспорта, при котором перенос­чиками генов выступают умеренные или вирулентные бактериофаги. Фраг­менты бактериальных хромосом обычно включаются в состав фаговых час­тиц либо в ходе неправильного вырезания профагов из бактериального гено­ма (характерно для умеренных вирусов), либо в ходе ошибочной упаковки в головки бактериальной ДНК при сборке вирулентных фагов. Образующиеся фаговые частицы носят название «дефектные», поскольку в большинстве слу­чаев не способны обеспечить литический цикл. Однако они сохраняют спо­собность адсорбироваться на клетках и инъецировать в них свою нуклеино­вую кислоту, которая может вступать в события рекомбинации с клеточным геномом.

Трансформация — способ генетического обмена, открытый Гриффитом, при котором в клетки проникает свободная ДНК. Трансформирующая спо­собность описана как для хромосомальных, так и для плазмидных ДНК. Про­цесс, в котором выделенная ДНК фагов поступает в бактериальные клетки и обусловливает образование в них зрелых фаговых частиц, называется транс­фекцией. В естественных условиях трансформация осуществляется с невысо­кой эффективностью за счет высвободившейся из спонтанно лизировавшихся клеток ДНК. В лабораторных условиях частоту трансформации можно суще­ственно повысить, увеличив концентрацию трансформирующей ДНК и пере­ведя клетки в компетентное состояние (только в таком состоянии клетки способны адсорбировать и поглощать ДНК). Еще легче трансформируются протопласты, и этот прием — один из самых распространенных при введении гибридных (полученных в экспериментах по генной инженерии) молекул ДНК в клетки.

Слияние протопластов представляет собой искусственный метод объеди­нения геномов. Он основан на способности плазматических мембран — пограничных структур протопластов — к спонтанной агрегации с обобществ­лением всего содержимого двух или более протопластов. При этом между геномами могут происходить сложные рекомбинационные события, сопрово­ждающиеся возникновением разных вариантов организмов.

Процессы трансформации клеток и протопластов, а также слияние прото­пластов используют и для селекции некоторых эукариотических организмов: дрожжей, мицелиальных грибов, растений.

Итак, перечисленные выше процессы приводят к поступлению в клетки нового генетического материала, который может подвергаться у бактерий рестрикции, если модифицирован неадeкватно имеющейся в клетке системе рестрикции—модификации, но может и успеть вступить во взаимодействие с резидентными молекулами ДНК — рекомбинацию. Рекомбинация свойствен­на всем группам организмов, за исключением РНК-содержащих вирусов (у них она не обнаружена). Это ферментативный процесс, и генетическая ин­формация о синтезе ферментов, опосредующих рекомбинацию, есть во всех клетках и у многих вирусов. Некоторые ферменты, играющие ключевую роль при рекомбинации, участвуют также в процессах репликации и репарации ДНК.

Различают три типа рекомбинации: общую (регулярную, гомологичную), сайт-специфическую и незаконную (негомологичную, случайную). Основ­ное отличие между этими типами заключается в протяженности сайтов гомо­логии, которые обусловливают взаимодействие молекул ДНК, приводящее к перекомбинированию генов.

Общая рекомбинация. Это обмен участками между гомологичными (идентичными) нуклеотидными последовательностями, или кроссинговер. При данном типе рекомбинации происходит разрыв гомологичных цепей ДНК с последующим реципрокным соединением их в новом сочетании (рис. 2.6). Обмен производится одноцепочечными участками, причем имею­щими одинаковую ориентацию. В процессе принимает участие большое ко­личество разнообразных ферментов. В частности общая рекомбинация у E. coli катализируется recA-белком (обеспечивает обмен одиночными цепя­ми), recBCD-нуклеазой (осуществляет разрыв и расплетение цепочек), геликазами и белками, связывающимися с одноцепочечной ДНК (необходимы для миграции креста Холлидея), а также ДНК-полимеразой РolI и ДНК-лигазой.

Г омологичная рекомбинация начинается с надрезания однонаправленных цепей в гомологичных молекулах ДНК, после чего свободные концы одной цепи спариваются со свободными концами другой цепочки, и формируется структура Холлидея (по имени исследователя впервые предложившего ее). Точка перекреста обменивающихся цепей перемещается вдоль рекомбини­рующих молекул — миграция ветви (креста). При этом происходит размыка­ние водородных связей между комплементарными нуклеотидами внутри од­ной родительской молекулы ДНК и замыкание соответствующих связей меж­ду нуклеотидами цепей, принадлежащих разным молекулам ДНК. Структуры Холлидея затем переходят в рекомбинантные двойные спирали (разрешают­ся) путем внесения разрывов и воссоединения цепей двумя альтернативными способами. В первом способе разрезаются и воссоединяются перекрещиваю­щиеся однонаправленные цепи, а в другом — неперекрещивающиеся однона­правленные цепочки. При миграции креста Холлидея осуществляется спари­вание цепей, принадлежащих разным молекулам ДНК, т. е. образуются гете­родуплексы. В их составе могут содержаться некомплементарные нуклеоти­ды, которые удаляются так же, как при репарации ДНК, а шаблоном в дан­ном случае может служить любая из цепей.

Существует альтернативный способ общей рекомбинации, в ходе которо­го происходит двухцепочечный разрыв в одной молекуле ДНК. В этом случае на одном из этапов тоже формируется структура Холлидея, и происходит ми­грация ветви.

Рис. 2.6. Этапы процесса рекомбинации между гомологичными молекула­ми ДНК: 1 — продукт разрезания и воссоединения перекрещивающихся цепей; 2 — продукт разрезания и воссоединения неперекре­щивающихся цепей

Сайт-специфическая рекомбинация. Этот способ рекомбинации не за­висит от продуктов генов recA, B и D и происходит между специфическими сегментами молекул ДНК, не имеющими протяженных областей гомологии. Лучше всего этот тип рекомбинации изучен на примере интеграции фага 1 в нуклеоид кишечной палочки и его обратного исключения. Рекомбинационные события при этом происходят в коротких участках ДНК бактериофага и клет­ки — att-сайтах (от англ. attachment — прикрепление). В составе фаговой ДНК присутствует аttРОР'-сайт, а в составе бактериальной ДНК — attВОB'-сайт, располагающийся между оперонами gal (отвечает за утилизацию галак­тозы) и bio (отвечает за биосинтез биотина). Нуклеотидные последовательно­сти att-сайтов на фаговой и клеточной ДНК различаются, за исключением участка «О» протяженностью 15 пар нуклеотидов, одинаковых для обоих сай­тов. Эта последовательность, общая для рекомбинирующих геномов, служит для образования «липких» концов за счет двух надрезов уступом (рис. 2.7). Образование этих надрезов катализирует белок Int — продукт фагового гена int.

ДНК фага 1 проникает в клетку в линейной форме и сразу замыкается в кольцо благодаря существованию «липких» концов. Затем на фаговую и бак­териальную ДНК воздействуют нуклеазы (белок Int), и образующиеся «лип­кие» концы в составе разных att-сайтов могут взаимодействовать, приводя к интеграции профага в хромосому (рис. 2.8).

Рис. 2.7. Нуклеотидная последовательность участка «О», входящего в со­став att-сайтов: стрелками показаны места надрезов уступом

Рис. 2.8. Интеграция ДНК фага λ в хромосому E. coli

В результате сайт-специфической рекомбинации, сопровождающей про­цесс интеграции ДНК фага λ в нуклеоид кишечной палочки, происходит об­разование новых (рекомбинантных) сайтов: ВОР' и РОВ' (рис. 2.8).

Исключение профага λ из хромосомы E. coli может происходить также в результате сайт-специфической рекомбинации, и в этом процессе, кроме бел­ка Int, играют роль фаговый белок Xis и клеточный белок HF. Следует отме­тить, что интеграция профага 1 может осуществляться и в другие сайты нуклеоида E. coli, однако это происходит с частотой примерно в 200 раз мень­шей, чем интеграция между локусами gal и bio, и в таких случаях реализуют­ся закономерности незаконной рекомбинации.

Незаконная рекомбинация. Примерами незаконной (негомологичной) рекомбинации служат события транспозиции перемещающихся (мобильных) элементов, для которых в геномах отсутствуют предпочтительные сайты ин­теграции. Полагают, что для этих событий не требуются участки гомологии ДНК. К незаконной рекомбинации относят также процессы случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в клеточные геномы. Эти собы­тия наиболее часты для клеток животных.