Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Экспрессия генов
Транскрипция ДНК

Наследственная информация, записанная языком последовательности нуклеотидов, у большинства организмов (кроме РНК-содержащих вирусов) хранится в ДНК. Последовательность триплетов нуклеотидов в генах опреде­ляет последовательность аминокислот в полипептидах или рибонуклеотидов в молекулах транспортных и рибосомальных РНК. Для того чтобы генетиче­ская программа реализовалась (синтезировались нужные белки и РНК), тре­буется участие аппарата экспрессии генов. Под процессом экспрессии генов понимают синтез матричных РНК и белков. При этом мРНК выступают в роли посредников между ДНК и белком: синтез белка всегда осуществляется на однонитевых мРНК (при участии рибосом), а сами мРНК всегда синтези­руются на двухнитевых ДНК. Оба процесса относятся к числу матричных и подлежат регуляции, которая существенным образом сказывается на уровне клеточного метаболизма.

Экспрессия всех генов начинается с транскрипции их нуклеотидной по­следовательности. Транскрипция — это процесс перевода информации, запи­санной на языке последовательности дезоксирибонуклеотидов в смысловой цепи ДНК на язык последовательности рибонуклеотидов в мРНК. При этом определенный участок одной из двух цепей ДНК (антисмысловой) использу­ется как матрица для синтеза РНК путем комплементарного спаривания осно­ваний.

Ферментами, катализирующими процесс транскрипции, служат ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Причем у прокариот, например, в клетках ки­шечной палочки обнаружен лишь один тип этого фермента, который синтези­рует все три типа РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от них эукариоты имеют три разные ДНК-зависимые РНК-полимеразы, каждая из которых от­ветственна за транскрипцию генов, кодирующих разные типы клеточных РНК. Наилучшим образом процесс транскрипции, а также его ферментатив­ное оснащение изучены у прокариот. Бактериальные РНК-полимеразы — это сложные белки, состоящие из нескольких разных субъединиц. Наиболее изу­ченный фермент — холофермент РНК-полимераза E. coli, который содержит пять разных полипептидных субъединиц: две a-цепи, одну ß- и одну ß'-цепи, σ- и ω-цепи. Альтернативная форма фермента, называемая кором или ми­ниферментом, лишена σ-субъединицы. Кор-фермент катализирует большин­ство реакций транскрипции ДНК в РНК, однако не может инициировать син­тез РНК в нужном месте, поскольку не способен узнавать промоторные сайты. Точное связывание и инициация в промоторах происходят только после добавления к корферменту σδ-субъединицы и образования холофермента.

Как и другие матричные процессы, транскрипция включает 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация транскрипции. Для этого процесса необходимы: холофермент, специальная последовательность нуклеотидов в ДНК (промотор) и на­бор нуклеозидтрифосфатов. Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и специфической последова­тельностью, называемой промотором и располагающейся в начале всех транскрипционных единиц. Промотор — это участок молекулы ДНК, состоя­щий примерно из 40 пар нуклеотидов и расположенный непосредственно пе­ред участком инициации транскрипции. В нем различают две важные и дос­таточно консервативные по составу последовательности. Одна из них состоит из шести или семи нуклеотидов (чаще ТАТААТ) и расположена на расстоя­нии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида (+1); этот сигнал обычно обозначают как -10-последовательность, или Прибнов-Бокс — в честь ее первооткрывателя. В данном сайте РНК-полимераза связывается с ДНК. Вторая последовательность расположена на расстоянии ~ 35 нуклеотидов до сайта инициации и служит участком распознавания промотора РНК-полимеразой (рис. 3.1).

Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный комплекс. В нем происходит копирование последовательности нуклеотидов смысловой, или (+)-цепи ДНК, имеющей направление 5' → 3'. При этом син­тез мРНК всегда начинается с нуклеотидов А или G. Вторая, антисмысловая цепь ДНК, служит матрицей для синтеза цепочки РНК (рис. 3.2).

Транскрипция аналогична репликации в том смысле, что порядок присое­динения рибонуклеотидов определяется комплементарным спариванием ос­нований (рис. 3.2). После формирования первых нескольких фосфодиэфирных связей (обычно 5—10) δ-субъединица отделяется от инициирующего комплекса, и дальнейшая транскрипция осуществляется с помощью корфермента.

Рис. 3.1. Структура промотора E. coli (объяснения в тексте)

Рис. 3.2. Матричный принцип процесса транскрипции

Элонгация транскрипции. Растущая цепь РНК остается связанной с ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи. Остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По мере продолжения транскрипции движущийся вдоль цепи ДНК корфермент действует подобно застежке «молния», расплетая двойную спираль, которая замыкается позади фермента, и восстанавливается ее исходная дуп­лексная структура. «Раскрытая» ферментом область ДНК простирается всего на несколько пар нуклеотидов (рис. 3.3).

Наращивание РНК идет в направлении от 5'- к 3'-концу вдоль матричной (-) цепи, ориентированной в направлении 3' → 5', т. е. антипараллельно. Транскрипция непрерывно продолжается до тех пор, пока фермент не достиг­нет сайта терминации транскрипции.

Терминация транскрипции. Последовательности ДНК, являющиеся сиг­налами остановки транскрипции, называются транскрипционными термина­торами. Они содержат инвертированные повторы, благодаря чему 3'-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины (рис. 3.4).

Рис. 3.3. Транскрипция ДНК: в локальном участке «расплетенной» ДНК работает корфермент, синтезируя цепь мРНК в направлении 5'Р → 3'ОН

Рис. 3.4. Пример шпильки в составе мРНК, на которой заканчивается процесс транскрипции. В составе стебля шпильки присутствуют ком­плементарные нуклеотиды

Обнаружены два типа сигналов терминации — p-зависимый и р-независимый терминаторы. р — это олигомерный белок, прочно связываю­щийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до ADP и неорганиче­ского фосфата. В одной из моделей действие р-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в на­правлении 5' → 3' к месту синтеза РНК; необходимая для его перемещения энергия выделяется при гидролизе АТР. Если р-белок наталкивается на обра­зующуюся в РНК шпильку, он останавливает полимеразу, которая могла бы продолжить транскрипцию. Механизм p-независимой терминации изучен хуже, в нем остается много неясного.

В большинстве случаев первичные транскрипты, образующиеся описан­ным выше способом, не являются зрелыми молекулами РНК, а требуют про­цесса созревания, который называется процессингом РНК. Процессинг силь­но отличается для прокариотических и эукариотических РНК.

У прокариот первичные транскрипты, сформированные при транскрип­ции генов, кодирующих белки, функционируют в качестве мРНК без после­дующей модификации или процессинга. Причем трансляция мРНК часто на­чинается даже до завершения синтеза 3'-конца транскрипта. Совсем иная си­туация наблюдается для молекул прокариотических рРНК и тРНК. В этом случае кластеры рРНК- или тРНК-генов часто транскрибируются с образова­нием единой цепи РНК. Для формирования зрелых функциональных форм должны произойти специфическое надрезание первичных РНК-транскриптов и модификация. Эти молекулярные события и называют процессингом РНК или посттранскрипционной модификацией. Начальное расщепление пер­вичных транскриптов на фрагменты, содержащие либо тРНК, либо 16S-, 23S- или 5S-рРНК-последовательности, осуществляет эндонуклеаза РНК-аза Ш. Ее мишенями служат короткие дуплексы РНК, образующиеся при внутримо­лекулярном спаривании оснований в последовательностях, фланкирующих каждый из РНК-сегментов. Эти комплементарные последовательности фор­мируют шпильки, в составе которых РНК-аза вносит разрывы, после чего лишние последовательности спейсерных областей удаляются другими РНК-азами. Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде про-тРНК, которая на ~ 20 % длиннее, чем зрелая. Лишние последовательности, расположенные у 5' и 3'-концов, удаляются рибонуклеазами Q и P. Кроме этого, для образова­ния зрелой функциональной тРНК, по-видимому, должны произойти специ­фическая модификация оснований и присоединение одного, двух или всех трех нуклеотидов 3'-ССА-конца (акцепторная ветвь).

Созревание РНК у эукариот осуществляется гораздо сложнее. Во-первых, у эукариот существует ядро, которое отделено от цитоплазмы ядерной мем­браной. В ядре осуществляется образование первичных транскриптов, кото­рые имеют бульшую длину, чем цитоплазматическая мРНК, участвующая в трансляции. Следовательно, образованию зрелой мРНК у эукариот должно предшествовать удаление интронов из последовательности гяРНК-транскрипта (этот процесс называется сплайсингом от англ. to splice — сплетать, сращивать). После удаления последовательностей, соответствую­щих интронам, происходит соединение участков, которые транскрибированы с экзонов. Сплайсинг катализируется комплексами белков с РНК (мяРНП), которые, взаимодействуя с гяРНК, образуют сплайсому. Полагают, что ката­литической активностью в сплайсоме обладает РНК-составляющая. Такие РНК называют рибозимами. Место сплайсинга определяется в сплайсомах с высокой точностью, поскольку ошибка даже в 1 нуклеотид может привести к искажению структуры белка. Для точного узнавания в составе интронов есть специфические последовательности — сигналы.

Кроме сплайсинга, мРНК у эукариот подвергается модификации: на 5'-конце синтезируется «кэп» (шапочка) — структура, представляющая собой метилированный остаток гуанозинтрифосфата, который защищает РНК от гидролиза 5'-экзонуклеазами. На 3'-конце про-мРНК синтезируется полиаденилатная последовательность длиной 150—200 нуклеотидов, которая называ­ется «шлейф». Эти структуры принимают участие в регуляции экспрессии эукариотических генов. Процессинг рРНК и тРНК у эукариот осуществляется аналогично таковому у прокариот.