Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Экспрессия генов
Регуляция генной экспрессии на уровне транскрипции

Каждая клетка целого организма или популяции содержит полный набор генов, свойственный для данного вида (штамма). Однако в любой момент времени в клетке функционируют (экспрессируются) не все гены, а лишь те, в продуктах которых имеется потребность. Такое распределение «обязанно­стей» между генами возможно благодаря существованию механизмов регуля­ции генной экспрессии, которые функционируют на разных уровнях. С по­мощью этих механизмов клетка экономит свои ресурсы: в каждый конкрет­ный момент она синтезирует определенный ограниченный набор веществ, а не весь возможный их спектр и, кроме того, осуществляет координацию ме­таболических путей.

Среди нескольких уровней регуляции экспрессии генов наиболее сущест­венной и часто используемой является регуляция синтеза ферментов, которая осуществляется на уровне транскрипции. Суть такого типа регуляции сводит­ся к ускорению или замедлению процессов транскрипции определенных ге­нов, что в конечном итоге отражается на скорости синтеза их продуктов. Раз­личают позитивную и негативную регуляцию транскрипции. Негативная ре­гуляция предусматривает торможение инициации транскрипции за счет свя­зывания с операторной областью белков-репрессоров; позитивная регуля­ция — наоборот, охватывает события «включения» транскрипции, которые также обусловливаются присоединением к оператору специфических белков (в данном случае их называют активаторами).

Наилучшим образом регуляция синтеза ферментов изучена у прокариот. Их особенностью является организация генов, участвующих в одном метабо­лическом пути, в опероны. Это дает возможность прокариотам «включать» и «выключать» транскрипцию группы генов (входящих в оперон) одновремен­но. Несколько разных типов регуляции инициации транскрипции (оперонной регуляции) будет рассмотрено в данной теме на примерах двух оперонов E. coli — лактозном, принадлежащем к группе катаболитных оперонов, и триптофановом — анаболическом.

Регуляция инициации транскрипции у эукариот осуществляется гораздо сложнее, чем у прокариот, но основные ее закономерности соблюдаются и в этом случае.

Регуляция экспрессии лактозного оперона по типу индук­ции. Лактозный оперон E. coli содержит регуляторную область (промотор и оператор) и три структурных гена: lacZ (кодирует структуру ß- галактозидазы), lacY (определяет структуру ß-галактозидпермеазы) и lacA (структура ß-галактозидтрансацетилазы) (рис. 3.5). Названные ферменты обусловливают перенос в клетку дисахарида лактозы и расщепление ее на глюкозу и галактозу. Транскрипция структурных генов лактозного оперона осуществляется согласованно: гены lacZ, lacY и lacA транскрибируются в одну полицистронную мРНК, которая транслируется с образованием почти одинаковых количеств каждого из ферментных белков. Недалеко от лактозного оперона на хромосоме E. coli располагается ген I, кодирующий структу­ру белка-репрессора. Этот белок в свободном состоянии имеет сродство к операторной области lac-оперона.

Когда клетки кишечной палочки выращиваются на среде с глюкозой в ка­честве единственного источника углерода, они содержат очень мало бел­ков — продуктов структурных генов лактозного оперона: примерно по 10 молекул на клетку. В присутствии лактозы и других ß-галактозидов кон­центрация этих белков возрастает до 10 000 и более молекул на клетку. В этом случае лактоза (ß-галактозиды) служит индуктором синтеза названных ферментов, и это означает, что соответствующий оперон регулируется по типу индукции, т. е. кодируемые им ферменты синтезируются только в присутст­вии индуктора.

Рис. 3.5. Лактозный оперон E. coli (lac) и тесно сцепленный с ним ген lac-репрессора (lac I): Р — промотор; О — оператор

Механизм индукции состоит в следующем. В отсутствие индуктора сво­бодный белок-репрессор (тетрамерная молекула) прочно связывается с опера­торной областью lac-оперона (рис. 3.6). Поскольку промоторная и оператор­ная последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором становится помехой для присоединения РНК-полимеразы к промотору, что приводит к блокированию транскрипции структурных генов. Однако присут­ствие в клетке лактозы или иного индуктора lac-оперона приводит к образо­ванию комплекса индуктора с репрессором, который утрачивает сродство к оператору и освобождает регуляторную область (рис. 3.6). Осуществляется транскрипция структурных генов, и на сформированной мРНК синтезируются соответствующие белки.

Таким образом, существование явления индукции позволяет клетке эко­номить свои ресурсы, поскольку обеспечивает транскрипцию индуцибельных генов и синтез соответствующих ферментов не постоянно, а только при нали­чии индуктора в среде.

У бактерий E. coli получены мутации, которые выражаются в уменьше­нии или исчезновении сродства репрессора к оператору. У таких мутантов наблюдается конститутивный синтез ферментов лактозного оперона, т. е. его экспрессия наблюдается и в отсутствие индуктора.

Регуляция синтеза ферментов по типу индукции относится к негативному контролю. Кроме этого, работа лактозного оперона и многих других оперонов подвержена позитивной регуляции, которую можно рассмотреть на примере катаболитной репрессии.

Рис. 3.6. Репрессия lac-оперона гомотетрамерным lac-репрессором (ввер­ху) и индукция lac-оперона после связывания с репрессором ß- галактозидного индуктора (внизу)

Регуляция работы лактозного оперона по типу катаболитной ре­прессии. Позитивная регуляция транскрипции лактозного оперона заключа­ется в связывании активаторного комплекса со специфической последова­тельностью, расположенной в самом начале lac-промотора. Это приводит к стимулированию процесса транскрипции lac-оперона, в результате чего ско­рость синтеза соответствующей мРНК увеличивается почти в 50 раз. Данный феномен не имеет пока окончательного объяснения, однако существует не­сколько гипотез, описывающих процесс стимулирования транскрипции. Со­гласно наиболее общепринятой из них, активаторный комплекс связывается с той частью промотора, которая непосредственно прилегает к сайту присоеди­нения РНК-полимеразы (рис. 3.7) и усиливает сродство этого фермента к промотору. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание активаторного комплекса с промотором предотвращает присоединение РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и увеличивает тем самым вероятность связывания фермента с «правиль­ным» промоторным сайтом.

Функцию активатора транскрипции в данном случае выполняет комплекс циклического АМР (сАМР) с белком-активатором катаболизма (САР, от англ. catabolite activator protein). Этот комплекс выполняет аналогичные функции и при регуляции экспрессии многих других катаболитных оперонов. Свободный белок САР не способен связываться со специфической последова­тельностью в составе промотора и требует участия сАМР.

сАМР образуется из АТР (рис. 3.8) в ходе ферментативного превращения в ответ на различные клеточные события и сигналы. Это вещество-посредник принимает участие во многих процессах, и с его помощью осуществляется регуляция различных граней клеточного метаболизма. Содержание сАМР в клетке контролируется с помощью двух уравновешивающих друг друга про­цессов: синтеза при участии аденилатциклазы (рис. 3.8) и деградации под действием фосфодиэстеразы. Глюкоза ускоряет распад сАМР и ингибирует процесс его синтеза, т. е. в присутствии глюкозы наблюдается низкий, а в отсутствие — высокий уровень сАМР в клетке.

Таким образом, содержание сАМР и, соответственно, активаторного ком­плекса сАМР-САР зависит от наличия в клетке глюкозы. У бактерий, расту­щих на глюкозе, концентрация этих веществ очень низкая, поэтому даже в присутствии индукторов транскрипция лактозного и подобных ему оперонов не осуществляется, и в клетке не синтезируются ферменты, принимающие участие в катаболизме соответствующих сахаров (лактозы, арабинозы, галак­тозы и др.). Это явление и обозначают термином «катаболитная репрес­сия».

Регуляция работы триптофанового оперона по типу репрес­сии. Триптофановый оперон E. coli содержит в своем составе пять структур­ных генов (trpE, trpD, trpC, trpB, trp. I). определяющих аминокислотные

Рис. 3.7. Нуклеотидные последовательности, принимающие уча­стие в регуляции экспрессии лактозного оперона

Рис. 3.8 Синтез циклического АМР (сАМР) из АТР

последовательности пяти ферментов, участвующих в превращении хоризмата в триптофан. Кроме этого, в состав оперона входит лидерный сегмент trpL и регуляторная область (перекрывающиеся последовательности промотора и оператора), принимающие участие в регуляции транскрипции структурных генов (рис. 3.9). В ином сайте нуклеоида кишечной палочки (на достаточном удалении от trp-оперона) расположен ген trpR, кодирующий структуру белка-репрессора.

Структурные гены trp-оперона транскрибируются в виде полицистронной мРНК длиной 7000 нуклеотидов. Синтез мРНК инициируется на промоторе, последовательность которого перекрывается с оператором (рис. 3.9). Транс­крипция контролируется взаимодействием с оператором белка-репрессора, эффектором которого служит конечный продукт данного биосинтетического пути — триптофан. Когда в клетке присутствует свободный триптофан, он связывается с репрессором и оказывает аллостерическое воздействие на структуру последнего, в результате чего репрессор приобретает способность прочно связываться с оператором. В этом случае триптофан выполняет роль корепрессора триптофанового оперона.

Связывание комплекса триптофан — репрессор с операторной областью препятствует правильному взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, поскольку последовательности оператора и промотора перекрываются. Транскрипция trp-оперона блокируется, и ферменты, участвующие в синтезе триптофана, не образуются.

В отсутствие триптофана не происходит связывания свободного белка-репрессора с оператором, и транскрипция оперона не нарушается. В данном случае происходит интенсивный синтез пяти ферментов, превращающих хоризмат в триптофан. Благодаря процессам регуляции содержание этих ферментов в клетке E. coli может различаться до 700 раз в зависимости от внутриклеточного уровня триптофана.

Рис. 3.9. Триптофановый оперон E. coli (trp-оперон). Продукты структурных ге­нов: а1 — антранилатсинтаза, компонент I; а2 — антранилатсинтаза, компонент II — фосфорибозилантранилаттрансфераза; pr — фосфорибозилантранилатизомераза-индолглицеролфосфатсинтетаза; t1 — триптофансинетаза ß; t2 — триптофансинтетаза a. Промежуточные метаболиты: PR — фосфорибозил; CdRP — карбоксифениламинодезоксирибулозофосфат; InGP — индолглицерофосфат; PRPP — фосфорибозилпирофосфат

С помощью репрессии регулируется работа и других оперонов, в частно­сти тех, которые участвуют в биосинтезе других аминокислот. Для некоторых из этих оперонов характерен еще один способ регуляции — аттенуация.

Аттенуация экспрессии триптофанового оперона. Этот способ регу­ляции экспрессии trp-оперона связывает между собой два процесса: транс­крипцию и трансляцию. В нем задействован регуляторный сегмент ДНК, рас­положенный перед структурным геном trpE. Этот так называемый лидерный сегмент trpL содержит аттенуаторную последовательность длиной ~ 145 пар нуклеотидов. При наличии свободного триптофана в клетке осуществляется транскрипция аттенуаторной последовательности, после чего происходит ее преждевременная терминация и отделяется trp-лидерная мРНК (145 нуклеотидов). При отсутствии триптофана преждевременной термина­ции не происходит и транскрибируется полноразмерная триптофановая мРНК. Таким образом, в составе аттенуаторной последовательности содер­жится сигнал, регулирующий транскрипцию структурных генов.

Секвенс-анализ аттенуаторной последовательности позволил обнару­жить в ее составе три необычных сегмента: один из них кодирует структуру короткого полипептида, в состав которого входит 14 аминокислот, в том чис­ле два расположенных рядом остатка триптофана; два других сегмента со­держат инвертированные повторы, способные образовывать шпильки разной структуры при спаривании комплементарных нуклеотидов. Одна из двух шпилечных структур не препятствует процессу транскрипции, а вторая опо­средует p-независимую преждевременную терминацию транскрипции. Какая именно из двух шпилечных структур будет реализована, зависит от концен­трации триптофана в клетке: при его отсутствии (или невысоком содержании) не может полностью синтезироваться короткий пептид, содержащий два тан­демных повтора данной аминокислоты, и это служит сигналом для формиро­вания шпильки, не препятствующей транскрипции. При содержании трипто­фана в клетке на уровне от среднего до высокого происходит синтез коротко­го пептида, кодируемого аттенуаторной последовательностью, и в этом случае рибосомы доходят до терминирующего кодона в лидерной мРНК, что обу­словливает формирование шпилечной структуры, прерывающей дальнейший процесс транскрипции. Таким образом, аттенуация преждевременной терми­нации транскрипции происходит при низком содержании или почти полном отсутствии триптофана в клетке, и сигналом для этого служит особое поло­жение рибосомы на лидерной мРНК.

Экспрессия триптофанового, а также некоторых других анаболических оперонов (гистидинового, треонинового, изолейцинвалинового) достигает максимума в отсутствие репрессии и при максимальной аттенуации термина­ции транскрипции.