Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Структура и функции клеточных компонентов
Белки. Особенности организации и функции ферментов
Механизм ферментативного катализа

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс. При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и мо­лекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное состояние, — высокоэнергетическая промежуточная структура, которая энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важ­нейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабили­зации переходного состояния —взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации. Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного состояния соответствует свободной энергии активации (∆G#). Скорость реак­ции зависит от величины ∆G#: чем она меньше, тем больше скорость реак­ции, и наоборот. По сути ∆G# представляет собой «энергетический барьер», который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образо­вавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реак­ции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизо­сти друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фик­сация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических связей ориентация (эффект ориентации).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки (существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать ки­слотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофиль­ный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим пред­ставляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной поли­пептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгенострук­турный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов, образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «ще­ли» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести са­харных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F) (рис. 6.4).

Рис. 6.4. Расположение гексосахаридного звена муреина в активном цен­тре молекулы лизоцима: NAG — остаток N-ацетилглюкозамина; NAM — остаток N-ацетилмурамовой кислоты; заштрихованная часть рисунка — область активного центра лизоцима

Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосред­ственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 ами­нокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая 35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота — 52-е положение в полипептиде (рис. 6.5).

Рис. 6.5. Механизм гидролиза гликозидной связи в молекуле му­реина с участием фермента лизоцима

Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверх­ностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной свя­зи — примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в непо­лярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата — в полярном ок­ружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей.

Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонирован­ная карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С1-атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D (стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт, включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в

участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом. Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается, принимая конформацию полукресла, в которой пять из шести атомов, обра­зующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структу­ра соответствует конформации переходного состояния. При этом С1 -атом ока­зывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит назва­ние карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной кар­боксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).

На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая заме­щает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток. Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН-) к атому С1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реак­ции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию расщепления дисахарида (рис. 6.5).