Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Практическое использование методов генетической инженерии
Получение эукариотических белков и решение проблем экспрессии чужеродных генов

Одним из наиболее значимых достижений генетической инженерии явля­ется клонирование эукариотических генов, что дает возможность осуществ­лять синтез микробными клетками важнейших для народного хозяйства бел­ков — ферментов, гормонов, иммуномодуляторов и др. Эукариотические ор­ганизмы-доноры генетического материала характеризуются гораздо менее высоким уровнем продукции природных белков, чем генноинженерные штаммы-продуценты. Поэтому получение практически ценных белков для изучения их структуры и свойств, а также для использования в хозяйствен­ных целях осуществляют чаще с использованием гибридных микробных штаммов, а не культур клеток растений и животных или их органов и тканей. Названным способом получены такие ценные белки, как гормон роста чело­века и некоторых животных, инсулин, фактор роста эпидермиса человека, фактор некроза опухолей человека и мыши, a-, ß- и у-интерфероны, медиа­тор нервной системы соматостатин, гормон кальцитонин, миоглобин, гормо­ноподобные сигнальные белки интерлейкины, фактор свертывания крови, отсутствующий у больных гемофилией, обратная транскриптаза вируса лей­коза мышей, урокиназа, трипсин, некоторые онкобелки, вакцины против не­которых вирусов и др.

Когда ген в составе векторной молекулы переносится из клеток одного ор­ганизма в клетки другого, возникают проблемы с его экспрессией — транскрипция и трансляция мРНК могут не осуществляться вовсе либо про­исходить с низкой частотой. Это является следствием специфичности фер­ментов, катализирующих процессы транскрипции и трансляции, к определен­ным последовательностям ДНК (мРНК), структура которых бывает уникаль­ной у различных таксономических групп организмов. Чаще всего проблемы экспрессии наблюдаются при клонировании эукариотических генов в клетках прокариот, в частности потому, что сигналы инициации транскрипции выс­ших эукариот не распознаются РНК-полимеразами бактерий.

Для достижения эффективной экспрессии клонированных генов исполь­зуют несколько подходов: 1) увеличение числа копий гена в клетке (ампли­фикация гена); 2) подстановку перед структурной частью чужеродного гена сильного промотора, распознаваемого РНК-полимеразой клетки-хозяина; 3) подстановку перед геном чужеродного белка регуляторного элемента, обеспечивающего эффективную инициацию трансляции; 4) стабилизацию образующейся мРНК и белкового продукта. Перечисленные методы достиже­ния высокого уровня экспрессии генов наилучшим образом разработаны для бактерий E.coli. Поскольку наличие такой методологии является определяю­щим условием конструирования новых продуцентов, кишечная палочка рас­сматривается как один из самых перспективных организмов, используемых для этой цели.

Амплификация генов. Для усиления экспрессии генов можно увеличить их количество в клетке. Осуществляют это двумя способами: увеличивая чис­ло копий рекомбинантных плазмид или увеличивая число копий гена в соста­ве плазмиды.

Наиболее прост первый способ. Уже указывалось, что для конструирова­ния векторов предпочтительнее использовать мультикопийные плазмиды, находящиеся под нестрогим контролем репликации. В этом случае число ко­пий плазмид составляет 10—200. Данный показатель можно увеличить до нескольких тысяч, если подавить синтез белков бактериальной клетки или использовать мутантные плазмиды. Применение таких векторов позволяет значительно увеличить дозу целевого гена, а значит, и выход белкового про­дукта. Следует, однако, учитывать, что чрезмерная амплификация плазмид может приводить к снижению жизнеспособности штамма-продуцента из-за высокой токсичности некоторых чужеродных белков для бактерий, а также из-за увеличения времени генерации клеток.

Копийность генов в составе векторных молекул обеспечивают, создавая опероны с повторяющимися идентичными цистронами чужеродных генов. Сочетание перечисленных методов позволяет повысить дозу гена в клетке от нескольких десятков до тысяч копий на нуклеоид и увеличить уровень синтеза соответствую­щих белков (в ряде случаев на 1—2 порядка).

Достижение высокого уровня транскрипции чужеродных генов. Для того чтобы эукариотические гены транскрибировались в прокариотических клетках, их обычно подставляют под контроль сильных промоторов (обес­печивают высокую частоту событий инициации транскрипции) прокариот. Наиболее часто для этих целей используют сильные промоторы кишечной палочки: лактозного оперона — P_lacUV5, триптофанового — P_trp; гибридные промоторы, например P_trp-lacUV5 (P_tac), а также промоторы фага λ — P_R, P_L и других фагов (Т5, Т7, фХ174). Выделение этих промоторов и включение их в состав векторов осуществляют в ходе генно-инженерных манипуляций.

Еще более совершенной является методология использования регулируе­мых промоторов, которые инициируют процесс эффективной транскрипции лишь в определенных условиях. Такими промоторами являются, например, P_R и P_L фага λ. Их используют в клетках, содержащих температурочувстви­тельный d-репрессор, ген которого может быть расположен на векторе или совместимой с ним плазмиде. В таких клетках экспрессия чужеродного гена под контролем P_R или P_L будет происходить лишь после инактивации репрес­сора повышением температуры ферментации.

Использование прокариотических регуляторных элементов, расположен­ных на многокопийных плазмидах, позволяет достигать уровня синтеза мРНК чужеродного гена до 25% от всей РНК бактериальной клетки.

Достижение высокого уровня трансляции чужеродных генов. Еще одним условием эффективной экспрессии клонированных генов является на­личие перед геном чужеродного белка оптимального сайта инициации транс­ляции мРНК. На частоту событий трансляции первостепенное значение ока­зывает структура участков мРНК, обеспечивающих ее связывание с рибосо­мой и тРНК. Показано, что олигонуклеотидная последовательность, располо­женная на 5'-конце и непосредственно примыкающая к стартовому кодону, обеспечивает комплементарное спаривание с нуклеотидами антикодоновой петли тРНК. В то же время среди нуклеотидов мРНК, участвующих во взаи­модействии с рибосомой, достоверно установлена роль пуринбогатого участка на расстоянии 3—15 нуклеотидов от стартового кодона (последовательность Шайн—Дальгарно, или SD-последовательность). Длина SD-последовательности, а также ее расположение относительно стартового кодо­на существенно сказываются на связывании рибосом с мРНК, а значит, и на частоте событий инициации трансляции.

Известно три основных подхода к конструированию векторов, обеспечи­вающих трансляцию чужеродной ДНК в бактериальных клетках. Одним из наиболее распространенных является метод конструирования «гибридных участков связывания рибосом». Суть его заключается в том, что структурная часть чужеродного гена (с собственным стартовым кодоном и несколькими нуклеотидами перед ним) включается между последовательностью SD и стар­товым кодоном прокариотического гена. Такой метод имеет преимущество, состоящее в образовании полноразмерного чужеродного белка. Однако суще­ственным недостатком метода является трудность достижения оптимального удаления стартового кодона от SD-последовательности, что, как указывалось, очень существенно для инициации трансляции. Поэтому применяют другой подход, в котором чужеродный структурный ген, лишенный собственных ре­гуляторных областей, внедряют в состав хорошо экспрессируемого бактери­ального гена. Для этих целей чаще всего используют lас-промотор с соответ­ствующей последовательностью Шайна—Дальгарно. Сайт внедрения должен быть достаточно удален от места инициации трансляции, чтобы новая нук­леотидная последовательность не мешала эффективной инициации транс­крипции и трансляции бактериального гена. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором N-концевая часть представлена аминокислотами прокариотического пептида. Поэтому для выделения эука­риотической полипептидной цепи требуется дополнительная химическая или ферментативная обработка.

Наконец, третий подход к конструированию векторов, обеспечивающих эффективную трансляцию, использует принцип «перекрывания» генов. В этом случае чужеродный ген встраивают в концевую часть прокариотическо­го гена таким образом, что SD-последовательность второго гена расположена непосредственно в кодирующей области первого. При этом терминирующий трансляцию кодон первого гена является частью инициирующего кодона вто­рого гена. Этот метод разработан в 1985 г. в СССР. Он позволяет достигать 100%-ной инициации трансляции второго гена, поскольку рибосомы, транс­лировавшие первую часть полицистронной мРНК, не отсоединяются от нее, а происходит реинициация трансляции второго гена. Таким образом, применение векторов с частично перекрывающимися генами в оперонах позволяет обеспечить эффективность инициации трансляции чужеродного гена не ниже, чем у исходного прокариотического цистрона.

Стабилизация мРНК и белкового продукта чужеродного ге­на. Стабильность мРНК в клетках бактерий можно повысить введением му­таций, инактивирующих РНКазы. Кроме этого, на стабильность мРНК влияет полинуклеотидфосфорилаза (pnp). Известны мутанты E.coli по генам pnp, в которых время полужизни мРНК, определяющей чужеродные белки, увели­чивается в 1,5 раза.

Серьезным препятствием при получении штаммов-сверхпродуцентов мо­жет стать протеолиз чужеродных белков в клетке. Ведь набор клеточных пеп­тидаз как раз и предназначен в основном для быстрой деградации полипеп­тидов с «аномальной» структурой, которые возникают, например, в результа­те ошибок трансляции. Для стабилизации чужеродных белков можно исполь­зовать в качестве реципиентов штаммы, дефектные по системе деградации белков (low-, htpR или deg-мутанты). Можно также вводить в бактериальную клетку ген pin бактериофага Т4, который контролирует синтез ингибиторов протеиназ, или другие гены с похожими функциями.