Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Создание и анализ клонотек геномов
Секвенирование ДНК

Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секвенирование) является одной из важных, а часто и обязательных стадий изучения генома. Секвенированию подвергают очищенные (однородные) фрагменты однонитевой ДНК длиной 100—200 нуклеотидов. Получить такие фрагменты можно в ходе следующих операций: методом клонирования добиваются однородности рекомбинантных ДНК в составе одного клона; выделяют векторную ДНК из клеток; с помощью рестрикционных ферментов расщепляют клонированный сегмент ДНК на фрагменты указанной величины; при повышении температу­ры добиваются денатурации ДНК, получая однонитевые молекулы. Есть и более простой способ подготовки ДНК (пригоден для метода Сэнгера) — клонирование однонитевых фрагментов ДНК в составе векторов на основе фага М13.

Широко применяются два метода секвенирования: метод химического расщепления Максама и Гилберта и метод обрыва цепи Сэнгера. Наиболее современным и менее трудоемким считается метод обрыва цепи Сэнгера.

Секвенирование ДНК методом обрыва цепи. Этот метод основан на ис­пользовании специфических терминаторов синтеза ДНК — 2',3'-дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Эти молекулы нормально включаются в растущие цепи ДНК через свои 5'-трифосфатные группы, однако не обра­зуют фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеозидтрифосфатом (dNTP). Когда в реакционную смесь для синтеза ДНК наряду с четырьмя нормальными dNTP вводят небольшое количество какого-либо дидезоксиNTP (например, ddATP), синтезируется набор цепей, специфически терминиро­ванных данным ddNTP. Если с одним и тем же фрагментом ДНК поставить четыре отдельные реакции, каждую с одним из ddNTP, то в каждой реакции образуется смесь вновь синтезированных молекул разной длины. При этом получается, что все синтезированные в такой системе цепи ДНК будут иметь одинаковый 5'-конец (он обусловлен использованием одной и той же затрав­ки) и одинаковые нуклеотиды на 3'-конце. Теперь такие продукты можно раз­делить с помощью электрофореза в геле и определить по относительной дли­не образованных цепочек ДНК последовательность нуклеотидов в них (рис. 20.9).

Последовательность этапов в методе следующая: 1) получают однонитевые фрагменты ДНК, последовательность нуклеотидов в которых требуется определить (ДНК-матрицы); 2) синтезируют набор ddNTP; 3) синтезируют короткий фрагмент меченой ДНК, комплементарный 3'-концу матрицы (за­травка); 4) готовят четыре реакционные смеси для синтеза ДНК, в состав ка­ждой из которых входит какой-либо один ddNTP и соответствующий dNTP в строго определенном соотношении, а также три других dNTP; 5) в каждой из реакционных смесей дают осуществиться синтезу ДНК. Если соотношение ddNTP : dNTP выбрано правильно, образуется набор меченых молекул, дли­ны которых равны расстояниям от остатков данного ddNTP до начала цепи; 6) денатурируют полученные смеси ДНК, добиваясь образования однонитевых молекул; 7) разделяют фрагменты по размеру методом электрофореза в геле (в пористом агарозном или полиакриламидном геле под действием элек­трического поля молекулы движутся со скоростью, обратно пропорциональ­ной их величине); 8) проводят радиоавтографию и по картине распределения меченых фрагментов устанавливают нуклеотидную последовательность.

Наиболее современной модификацией метода Сэнгера является использование клонированных в векторах на основе фага М13 однонитевых фрагментов ДНК. Место генома М13, в которое встраивается чужеродная ДНК, точно известно. Поэтому получены 8—10-членные олигонуклеотиды, комплементарные участку ДНК М13, непосредственно прилегающему к кло­нированной последовательности. Эти нуклеотиды и служат затравками в по­лимеразных реакциях, т. е. появляется возможность использования одной и той же синтетической затравки для секвенирования любых вставок в данный вектор.

Рис. 20.9. Схема секвенирования ДНК по методу Сэнгера

При оптимальных условиях с помощью данного метода можно в одном эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни нуклео­тидов.

Секвенирование ДНК методом химического расщепления. Для фикса­ции начальной точки рестрикционных фрагментов ДНК осуществляют мечение их 5'-конца радиоактивным изотопом фосфора ³²Р с помощью фермента полинуклеотидкиназы (рис. 20.10). Затем денатурируют ДНК, получая однонитевые цепи, и делят препарат на четыре порции. Каждую порцию обраба­тывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех возможных азотистых оснований. Условия этой реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. После этого поврежденные молекулы обраба­тывают пиперидином, который обусловливает разрывы цепей за нуклеотидом с поврежденным основанием. В результате получаются смеси, содержащие фрагменты разной длины, среди которых только меченые имеют «фиксиро­ванную» начальную точку (5'-конец), и они смогут быть выявлены при ра­диоавтографическом анализе. Например, если во фрагменте длиной 10 нуклеотидов гуанилат находился в 3, 8 и 10 положениях, то при обработке реагентом, повреждающим гуанин, сформируются цепи из 3, 8, 10, 5 и 2 нук­леотидов. Из них только первые три, как содержащие радиоактивный изотоп фосфора, смогут образовать потемнение на рентгеновской пленке.

Рис. 20.10. Схема секвенирования ДНК по методу Максама—Гилберта

На заключительном этапе наборы меченых фрагментов, образующиеся при каждой из четырех реакций, подвергают электрофорезу в соседних до­рожках полиакриламидного геля. Происходит разделение фрагментов ДНК в соответствии с их размерами. Осуществляют радиоавтографию геля и читают последовательность нуклеотидов в анализируемой цепи. При этом первый нуклеотид в цепи определяется самым коротким фрагментом ДНК, т. е. по­следним на радиоавтографе геля (рис. 20.10).