Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Основы генетической инженерии
Практическое использование методов генетической инженерии
Генетическая инженерия на службе медицины и сельского хозяйства

Разработка методов клонирования и секвенирования ДНК позволила ус­тановить структуру геномов различных организмов: многих вирусов и бакте­рий, дрожжей, нематоды, дрозофилы, а к 2003 г. планируется завершить ра­боту по «прочтению» генома человека. Создалась ситуация, при которой ско­рость накопления человеком знаний в области молекулярной биологии опе­режает его умение пользоваться ими. Возникают морально-этические и пра­вовые проблемы, связанные с вопросами клонирования человеческих особей, получения и использования трансгенных животных, сопоставления и преда­ния огласке сведений из генетических паспортов индивидуумов и т. п. В то же время стремительными темпами развиваются прикладные сферы генети­ческой инженерии, особенно в области медицины и сельского хозяйства. Нельзя не остановиться на нескольких, особенно ценных методах генетиче­ской инженерии, позволивших открыть новую эру в лечении заболеваний человека, животных, растений, в выведении новых пород и сортов сельскохо­зяйственных объектов.

Полимеразная цепная реакция (PCR, или ПЦР). Это метод фермента­тивной амплификации сегментов ДНК или РНК, позволяющий многократно воспроизводить интересующий фрагмент ДНК (РНК) без помощи рестриктаз, векторов или клетки-хозяина. Метод осуществляется in vitro и полностью автоматизирован. Для PCR-реакции необходимы: два олигонуклеотида-праймера длиной ~20 нуклеотидов, комплементарных двум участкам на 3'-концах амплифицируемого фрагмента ДНК (рис. 21.4), набор дезоксинуклеозидтрифосфатов и термостабильная ДНК-полимераза. Праймеры синтезиру­ют химическим способом, выяснив предварительно структуру комплементар­ных участков, с которыми они должны спариваться. Термостабильный фер­мент выделяют из термофильных бактерий Thermus aquaticus.

На первой стадии двухнитевую ДНК, выделенную из клеток, нагревают до 90° С для денатурации (разделение цепей), затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация праймеров с комплементарными участками (отжиг). Далее устанавливают температуру, при которой происходит полимеризация цепей (70—75° С, в этом интервале фермент наиболее активен). После этого все события цикла повторяют, начиная с денатурации ДНК. Процесс осуще­ствляется в термостате-амплификаторе, работу которого контролирует ком­пьютер.

Рис. 21.4. Схема событий полимеразной цепной реакции (пояснения в тексте)

Данный циклический процесс повторяют с той же реакционной смесью 20—60-кратно. После третьего цикла амплификации начинают накапливать­ся двухнитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами (рис. 21.4). В каждом последующем цикле количество синтези­рованных фрагментов удваивается, т. е. за n циклов образуется 2n копий дуп­лексных сегментов с длиной, ограниченной праймерами.

Практическое применение метода PCR имеет несколько аспектов. Во-первых, с помощью амплификации определенных последовательностей ДНК, уникальных для определенных геномов или даже целых генов, можно обна­ружить данные сегменты даже при условии, что изначально они присутству­ют в клетках в очень малых дозах (числе копий). Например, начальные этапы вирусных инфекций характеризуются низким содержанием нуклеиновых ки­слот вирусов, но их можно обнаружить с помощью PCR-метода с последую­щей идентификацией при использовании зондов, комплементарных искомым последовательностям. Такие методы в настоящее время широко используют для детекции вирусов кори и краснухи, а также холерного вибриона.

Еще одним приложением метода является диагностирование наследст­венных заболеваний. Для многих наследственных заболеваний в настоящее время уже выявлены гены, а также их локусы, мутации в которых приводят к тяжелым болезням. Поскольку эти мутации передаются в поколениях инди­видуумов, для ответа на вопрос — будет ли будущий новорожденный нести ту или иную мутацию требуется выявить ее у плода (пренатальная диагности­ка). Для этого приблизительно на 16-й неделе беременности производят отбор амниотической (околоплодной) жидкости, из которой можно выделить клетки плода в ходе центрифугирования. Из клеток извлекают ДНК. Получить пре­паративные количества фрагментов ДНК, предположительно содержащие мутации, можно двумя путями: клонированием соответствующих фрагментов или их амплификацией методом PCR. Второй способ гораздо проще и дешев­ле. После того, как искомый фрагмент ДНК получен в достаточном количест­ве, можно осуществить его секвенирование и сопоставить нуклеотидные по­следовательности нормального и анализируемого генов. Существует и более простой способ выявления мутаций во фрагментах ДНК — блот-гибридизация.

Блот-гибридизация (блотинг по Саузерну). Этот метод разработан Саузерном в Эдинбурге. Он основан на способности гомологичных цепей ДНК гибридизоваться в подходящих условиях. Суть метода состоит в следующем. Исследуемую ДНК расщепляют рестриктазами на фрагменты, которые разде­ляют по размеру в ходе электрофореза в агарозном геле. Затем гель помеща­ют на нитроцеллюлозный фильтр и пропускают через него соответствующий буферный раствор в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. При этом фрагменты ДНК элюируются из геля и связываются с нит­роцеллюлозным фильтром, на котором в результате получается реплика геля. Для поиска нужных фрагментов ДНК на реплике проводят гибридизацию с меченым зондом, специфичным к искомому гену (фрагменту). Аналогичная методика используется для анализа РНК.

В основе обнаружения мутаций в генах лежит явление полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ или RFLP от англ. restriction fragment length polimorphism). Оно заключается в том, что последователь­ность ДНК, содержащая мутацию, может приобретать или, наоборот, утрачи­вать сайты рестрикции для тех или иных рестриктаз. Это можно обнаружить при разделении полученных фрагментов электрофорезом и гибридизацией с радиоактивным зондом. Сопоставление радиоавтографов для нормального и мутантного генов в этом случае позволяет обнаружить разницу в количестве и положении «полос» (рис. 21.5).

В качестве примера использования методов PCR и блот-гибридизации для ранней диагностики наследственных заболеваний можно привести прена­тальную идентификацию серповидно-клеточной анемии. Причиной этого не­дуга является мутация в гене, определяющем структуру ß-глобиновой цепи гемоглобина, в результате чего остаток глутамата в 6 положении (кодируется триплетом GAG) замещается на остаток валина (кодируется триплетом GTG). Измененный гемоглобин имеет тенденцию кристаллизоваться в эритроцитах, при этом они становятся менее гибкими, задерживаются в селезенке, и воз­никает их дефицит в крови. Мутацию легко идентифицировать с помощью рестрикционных ферментов Dde I и Mst II. Нуклеотидная замена аденилата на тимидилат в смысловой цепи ДНК, вызывающая серповидно-клеточную анемию, нарушает структуру сайтов рестрикции для названных ферментов, которые, однако, остаются не измененными в нормальном гене ß-глобина. Это отличие и выявляется в ходе анализа.

Получают ДНК ß-глобинового гена или его фрагмента, который может содержать данную мутацию, используя метод клонирования или (проще) — PCR-метод. Расщепляют фрагменты, например, с помощью Dde I и осущест­вляют блот-гибридизацию с меченной ³²Р ß-глобиновой ДНК. На радиоавто­графе геля для нормальной ДНК выявляются два фрагмента длиной 201 и 175 п. н., а для мутантной ДНК — только один фрагмент размером 376 п. н. (рис. 21.5).

PCR-метод совместно с блот-гибридизацией используются также в судеб­но-медицинской практике, в частности для установления отцовства, а также для идентификации принадлежности биологической пробы тому или иному лицу. В последнем случае обнаруженные на месте преступления образцы биологического материала (кровь, слюна, волосы) используются для извлече­ния ДНК, в которой амплифицируются определенные участки (наиболее ва­риабельные по структуре). То же проделывают с ДНК, выделенной из крови подозреваемых лиц. После расщепления амплифицированных фрагментов рестриктазами и блот-гибридизацией с мечеными зондами получают радио­автографы гелей. Сопоставление расположения «полос» на радиоавтографах позволяет ответить на вопрос о принадлежности биологических образцов.

Принцип метода основан на том, что одинаковые фрагменты ДНК, полу­ченной от генетически не идентичных индивидов, часто образуют рестрикци­онные фрагменты различной длины. Метод достаточно чувствителен, по­скольку PCR позволяет получать микрограммы ДНК-копий сегмента, даже когда он присутствует в препарате в составе единственной молекулы.

Рис. 21.5. Идентификация серповидноклеточного мутантного гена ß-глобина

Возможность идентификации мутаций в генах и умение получать практи­чески любые гены, лишенные мутаций, позволили приблизиться к лечению наследственных заболеваний. Возникло новое направление на стыке медици­ны и генетической инженерии — генотерапия, под которой подразумевают введение нуклеиновых кислот в клетку с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Основной подход генотерапии, реализуемый в настоящее время, состоит в выделении ДНК из больного организма, осуществлении исправления мутаций (например, в ходе сайт-специфического мутагенеза), введение исправленной ДНК в организм больного (метод ex vivo). Первый удачный результат генной терапии человека получен в США в 1990 г., когда с помощью методологии ex vivo удалось вы­лечить четырехлетнюю девочку с врожденным иммунодефицитом (мутация в гене аденозиндезаминазы). Внутривенно больной вводили собственные лим­фоциты, трансформированные нормальным геном аденозиндезаминазы, клонированном на ретровирусном векторе.

Еще одно приложение генноинженерных методов к медицинским пробле­мам состоит в производстве вакцин, отличающихся высокой надежностью, применение которых исключает риск заболеваний (в отличие от вакцин, по­лучаемых традиционными методами — инактивацией возбудителей). Разра­ботаны и широко применяются генноинженерные вакцины против гепатита В и А — очень опасных заболеваний, приобретающих характер эпидемий. Раз­рабатываются вакцины против СПИДа.

Основными достижениями генетической инженерии для сельского хозяй­ства можно считать создание трансгенных животных и растений. Трансген­ными считают такие особи животных, растений или микроорганизмов, гене­тическая программа которых изменена с использованием методов генной ин­женерии.

Трансгенных животных — коров, свиней, овец, коз — используют для секреции под промоторами «генов молока» высокоактивных биологических веществ для медицины и фармакологии. Уже прошли лицензирование и по­ступили на рынок полученные через трансгенных животных антитрипсин (для лечения легочных заболеваний), антитромбин III (для предотвращения инфарктов и инсультов), факторы свертываемости крови, лактоферрин (свя­зывает и транспортирует в организм железо, обладает биоцидными свойства­ми по отношению к патогенной микрофлоре, регулирует естественный имму­нитет, замедляет развитие опухолей). Первый трансгенный бычок, насле­дующий ген человеческого лактоферрина, получен в Голландии в 1990 г. Те­перь стада трансгенных коров с этим геном есть в нескольких странах.

Методы молекулярной диагностики в применении к животным позволяют выявлять не только гены с «вредными» мутациями, которые обусловливают наследственные заболевания, но и «полезные» гены, например детермини­рующие устойчивость к инфекционным заболеваниям (лейкоз, колибактериоз и др). Появляется возможность имплантировать эти гены селекционируемым животным.

Аналогичная ситуация наблюдается в отношении трансгенных растений. Изолированы гены, кодирующие ферменты деградации некоторых гербици­дов. Введение этих генов в растения позволило получить устойчивые к герби­цидам сорта. Другим примером является введение в геном растений модифи­цированных генов прототоксина Bacillus thuringiensis, в результате чего по­лучен картофель, устойчивый к колорадскому жуку, а также хлопок и кукуру­за, устойчивые к вредителям.

Показано, что растения могут производить белки животного происхожде­ния. Например, получены трансгенные растения табака, в которых собирают­ся полностью функциональные моноклональные иммуноглобулины, в частно­сти специфичные к бактериям, вызывающим кариес (перспектива получения антикариесной зубной пасты). Разработаны подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. В настоящее время у 120 видов растений существуют трансгенные формы. Раз­решено использование трансгенных сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля, томатов, свеклы, тыквы, табака, льна. Эти растения выращивают в 11 стра­нах мира. С их использованием, кроме перечисленных выше, решены такие проблемы, как устойчивость к вирусным, грибковым и бактериальным забо­леваниям, регуляция сроков созревания, повышение общей продуктивности, продукция съедобных вакцин.

Перечисленные достижения, связанные с внедрением методов генетиче­ской инженерии в медицину и сельское хозяйство, получены за очень корот­кий срок, в основном в ходе последнего десятилетия. При этом ни научная, ни широкая общественность не успела осознать всех последствий масштабного внедрения подобных разработок в практику. Никто в настоящее время не спо­собен гарантированно предсказать ни полную безвредность, ни безусловный вред от использования в пищу продуктов, полученных из генетически моди­фицированных организмов, от возделывания в неконтролируемых условиях (на естественных полях) трансгенных растений, от последствий генотерапии и т. п. Поэтому в странах, где проводятся подобные работы, существует сис­тема государственного контроля за генноинженерной деятельностью, переда­чей и использованием генетически модифицированных растений и животных. В большинстве государств приняты и действуют соответствующие законы, правительственные нормативные акты, строго регламентирующие требования к подобного рода исследованиям, порядок и ответственность научных органи­заций и государственных органов за безопасность при создании, выпуске в окружающую среду и использовании трансгенных животных и растений. Это становится особенно актуальным в связи с прогнозами специалистов, соглас­но которым в ближайшие годы на мировом рынке более 20 % объема всей экспортно-импортной продукции составят товары и продукты, полученные с помощью методов современной биотехнологии и биоинженерии.