Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Ферменты
Строение ферментов

По строению ферменты могут быть однокомпонентными, простыми бел­ками, и двухкомпонентными, сложными белками. Во втором случае в составе фермента обнаруживается добавочная группа небелковой природы.

В разное время возникли различные наименования белковой части и доба­вочной группы в двухкомпонентных ферментах. Все они до сих пор употребля­ются в литературе, например:

Добавочную группу, прочно связанную, не отделяемую от белковой части, называют простетической группой; в отличие от этого добавочную группу, легко отделяющуюся от апофермента и способную к самостоятельному су­ществованию, обычно именуют коферментом.

Химическая природа важнейших коферментов была выяснена в 30-е годы нашего столетия благодаря трудам О. Варбурга, Р. Куна, П. Каррера и др. Оказалось, что роль коферментов в двухкомпонентных ферментах играют большинство витаминов (Е, К, Q, В₁, В₂, В6, В₁₂, С, Н и др.) или соединений, построенных с участием витаминов (коэнзим А, НАД⁺ и т. п.). Формулы упомянутых коферментов приведены в гл. IV. Кроме того, функцию кофер­ментов выполняют такие соединения, как HS-глутатион, многочисленная группа нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры некоторых моноса­харидов и ряд других веществ.

Характерной особенностью двухкомпонентных ферментов является то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность доба­вочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная же группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязви­мой к денатурирующим агентам. Таким образом, хотя непосредственным исполнителем каталитической функции является простетическая группа, об­разующая каталитический центр, ее действие немыслимо без участия полипеп­тидных фрагментов белковой части фермента. Более того, в апоферменте есть участок, характеризующийся специфической структурой, избирательно свя­зывающий кофермент. Это так называемый кофермент связывающий домен; его структура у различных апоферментов, соединяющихся с одним и тем же коферментом, очень сходна. Таковы, например, пространственные структуры нуклеотидсвязывающих доменов ряда дегидрогеназ (см. рис. 53, с. 119).

Иначе обстоит дело у однокомпонентных ферментов, не имеющих доба­вочной группы, которая могла бы входить в непосредственный контакт с пре­образуемым соединением. Эту функцию выполняет часть белковой молекулы, называемая каталитическим центром. Предполагают, что каталитический центр однокомпонентного фермента представляет собой уникальное сочета­ние нескольких аминокислотных остатков, располагающихся в определенной части белковой молекулы. Сказанное иллюстрирует рис. 34, Г, на котором приведена третичная структура химотрипсиногена — предшественника одно­компонентного фермента: аминокислотные радикалы остатка сер и двух оста­тков гис, расположенные в разных точках полипептидной цепи, сблизились здесь на расстояние в несколько десятых долей нанометра, предобразовав каталитический центр фермента. На этом же рисунке (Б и В) приведена третичная структура молекул еще двух ферментов — лизоцима и рибонуклеазы; у них ясно просматривается двухъядерная, двухлопастная конструкция молекул с углублением (щелью) на границе двух лопастей, в котором распола­гается каталитический центр.

Чаще всего в каталитических центрах однокомпонентных ферментов встре­чаются остатки сер, гис, три, арг, цис, асп, глу и тир. Радикалы перечисленных аминокислот выполняют здесь ту же функцию, что и кофермент в составе двухкомпонентного фермента.

Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр одноком­понентного фермента, расположены в различных точках единой полипептид­ной цепи (см. рис. 34). Поэтому каталитический центр возникает в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру. Следовательно, изменение третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности.

Кроме каталитического центра, образованного сочетанием аминокислот­ных радикалов или присоединением кофермента, у ферментов различают еще два центра: субстратный и аллостерический (см. ниже, рис. 51).

Под субстратным центром понимают участок молекулы фермента, ответ­ственный за присоединение вещества (субстрата), подвергающегося фермента­тивному превращению. Часто этот участок называют «якорной площадкой» фермента, где, как судно на якорь, становится субстрат. Во многих случаях прикрепление субстрата к ферменту идет за счет взаимодействия с ε-аминогруппой радикала лиз, расположенного в субстратном центре. Эту же роль может выполнять СООН-группа глу, а также HS-группа цис. Однако работы последних лет показали, что гораздо большее значение здесь имеют силы гидрофобных взаимодействий и водородные связи, возникающие между ради­калами аминокислотных остатков субстратного центра фермента и соответст­вующими группировками в молекуле субстрата.

Понятие о каталитическом и субстратном центре не следует абсолютизиро­вать. В реальных ферментах субстратный центр может совпадать (или пере­крываться) с каталитическим центром. Более того, каталитический центр может окончательно сформироваться в момент присоединения субстрата. Поэ­тому часто говорят об активном центре фермента, представляющем сочетание первого и второго. Активный центр у ферментов располагается на дне щели при двухъядерной структуре, например у лизоцима и рибонуклеазы, или на дне глубокой впадины, как у химотрипсиногена (см. рис. 34).

Аллостерический центр представляет участок молекулы фермента, в ре­зультате присоединения к которому определенного низкомолекулярного (а иногда—и высокомолекулярного) вещества изменяется третичная структура белковой молекулы. Как следствие этого изменяется конфигурация активного центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитиче­ской активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции каталитической активности ферментов.

Рис. 46. Строение, некоторых ферментов-мультимеров:

А — молекула глутаматдегидрогеназы, составленная из 6 субъединиц (М = 56000), расположенных по граням правильного тетраэдра; молекулярная масса фермента 336000; Б — модель молекулы РНК-полимеразы из пяти субъединиц; две типа а (М — по 40000), две типа ß(ß — М = 150000 и ß' — M = 155000) и σ-фактор (М = 90000); В — схема строения половины молекулы каталазы; каждая субъединица пред­ставлена дважды изогнутой палочковидной частицей; Г — полиферментный комплекс, ускоряющий реакцию окислительного декарбоксилирования (см. с. 101, 160, 352—354); Д — аспартат-карбамилт-рансфераза, составленная из 6 каталитических (М = 33500, обозначены C₁— С₆) и 6 регуляторных (М = 17000, обозначены R1—R4; R5 и R₆не видны) субъединиц

Значения молекулярных масс ферментов колеблются в широких пределах: от нескольких тысяч до нескольких миллионов. В природе насчитывается несколько десятков ферментов, обладающих сравнительно небольшими моле­кулами (до 50 тыс.). Строение некоторых из них показано на рис. 34. Однако большинство ферментов представлено белками более высокой молекулярной массы, построенными из субъединиц (рис. 46). Так, каталаза (М = 252 000) содержит в молекуле шесть протомеров с М = 42000 каждый. Молекула фермента, ускоряющего реакцию синтеза рибонуклеиновых кислот (РНК-полимераза, М = 475 000), состоит из 5 неравных субъединиц. Полная молекула глутаматдегидрогеназы, ускоряющей процесс окисления глутаминовой кисло­ты (М = 336 000), построена из 6 субъединиц с М = 56000.

Способы компоновки протомеров в мультимеры разнообразны. Некото­рые из них показаны на рис. 46. Крайне важно, что построенный из субъеди­ниц фермент проявляет максимальную каталитическую активность именно в виде мультимера: диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента. Не все ферменты-мультимеры построены исключительно из ката­литически активных протомеров. Наряду с каталитическими в их составе отмечены регуляторные субъединицы, как, например, у аспартат-карбамил- трансферазы (рис. 46).

Среди ферментов-мультимеров безусловно преобладают димеры и тетраме­ры (их несколько сотен), в меньшей мере распространены гексамеры и октамеры (несколько десятков) и необыкновенно редко встречаются тримеры и пентамеры.

Молекулы ферментов-мультимеров в ряде случаев составлены из субъединиц двух типов, обозначаемых условно как субъединицы типа А и В. Они сходны друг с другом, но отличаются по некоторым деталям первичной и третичной структур. В зависимости от соотношения протомеров типа А и В в мультимере последний может существовать в виде нескольких изомеров, которые называют изозимами. Так, при четырех субъединицах возможны 5 изозимов:

Это явление хорошо изучено у фермента, ускоряющего в мышцах превра­щение молочной кислоты в пировиноградную и обратно:

Так как окисление молочной кислоты (acidum lacticwn) сопровождается отнятием атомов Н, этот фермент называют лактатдегидрогеназой. Молеку­ла лактатдегидрогеназы (М = 140 000) составлена из четырех субъединиц (М = 35000), которые условно обозначают Н и М (от англ. heart — сердце и muscle — мышцы), так как из сердца и скелетных мышц выделены І и V ти­пы лактатдегидрогеназы. Следовательно, изозимы лактатдегидрогеназы таковы:

Они отличаются друг от друга по степени активности, некоторым физическим свойствам (например, молекулярной массе, электрофоретиче­ской подвижности), локализации в органах и тканях и т. п. В зависимости от возраста, физиологического состояния и других причин в организме устанавливается то или иное соотношение изозимов, которому соответст­вует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение соот­ношения изозимов во всем организме или в отдельных тканях и органах представляет, таким образом, один из способов регуляции действия фер­ментов.

В настоящее время интерес к изозимам резко повысился. Оказалось, что кроме генетически детерминированных изозимов существует большая группа ферментов, обладающая множественными формами, возникающими в резуль­тате их посттранслякционной модификации (см. гл. VII). Множественные формы ферментов и изозимы в частности используются сейчас для диагности­ки болезней в медицине, прогнозирования продуктивности животных, подбора родительских пар при скрещивании для обеспечения максимального гетерозиса в потомстве и т. п.

Значение пространственной организации ферментов особенно ярко вы­является при изучении строения так называемых мультиэнзимов, т. е. ферментов, обладающих способностью ускорять одновременно несколько химических реакций и осуществлять сложные превращения субстрата. Примером может служить мультиэнзим, ускоряющий реакцию окисли­тельного декарбоксилирования пировиноградной кислоты (см. гл. VIII). Этот многоферментный комплекс с М = 4 500000 состоит из трех видов ферментов. Первый из них (Е₁) ускоряет реакцию декарбоксилирования пировиноградной кислоты. В состав комплекса входит 12 димерных молекул этого фермента (М = 192 000), изображенных на рис. 46, Г в виде крупных белых шаров, расположенных попарно по периметру рисунка. Второй и третий ферменты, катализирующие окислительно-восстанови­тельные процессы при окислении пировиноградной кислоты, сосредоточены внутри мультиэнзимного комплекса. Один из них (Е₃) представлен шестью димерными молекулами (М = 112 000), другой (Е₂) — 24 протомерами (М = 70 000) (см. рис. 46, заштрихованные крупные и мелкие шары со­ответственно).

В тех случаях, когда мультиэнзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют метаболоном (от слова метаболизм—обмен веществ). Таковы метаболоны глико­лиза (см. гл. VIII), биосинтеза ряда аминокислот (см. гл. VII), цикла дикарбо­новых и трикарбоновых кислот (см. гл. VIII) и др.

В результате слаженного во времени и пространстве действия всех трех видов входящих в его состав ферментов мультиэнзим с огромной скоростью осуществляет превращение пировиноградной кислоты. Именно в кооперативном характере каталитического процесса и кроется главное от­личие биокатализаторов от катализаторов неорганической природы, именно поэтому интенсивность биокатализа в десятки, сотни и тысячи раз превос­ходит мощность действия неорганических катализаторов.

Сравнительно недавно выявлена еще одна своеобразная черта в строении ферментов: некоторые из них являются полифункциональными, т. е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипеп­тидной цепью. Дело в том, что эта единая цепь при формировании третичной структуры образует несколько функционально и стерически обособленных глобулярных участков — доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью. В последующих главах будут приведены соот­ветствующие примеры.

При изучении мультиэнзимных комплексов и полифункциональных фер­ментов удалось понять наиболее важную особенность ферментативного катализа, а именно — эстафетную передачу промежуточных продуктов реак­ции от одного компонента каталитической системы к другому без их высвобождения.