Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Ферменты
Кинематика ферментативных реакций

Под ферментативной кинетикой в широком смысле понимают зави­симость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы реагирующих веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия (концентрация, температура, pH среды, наличие активаторов или инги­биторов и т. п.). Однако зависимость скорости ферментативного процесса от температуры, pH среды и влияния ингибиторов и активаторов в зна­чительной мере связана с изменением свойств фермента как белкового тела. Поэтому здесь будет освещен только вопрос о закономерностях, определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их из­менением.

Как показано выше, первой фазой биокаталитического процесса является образование фермент-субстратного комплекса:

Эта равновесная система может быть охарактеризована соответствующей константой равновесия. Величину, обратную ей, называют константой дис­социации фермент-субстратного комплекса или субстратной константой и обозначают K_s:

Она зависит от природы субстрата и фермента и отражает степень их сродства. Так, для сахаразы (фермент, ускоряющий реакцию гидролиза са­харозы) К_s = 0,0167М, т. е. концентрация фермент-субстратного комплекса превышает концентрацию свободных фермента и субстрата примерно в 60 раз. Чем ниже значение К_s, тем выше, следовательно, сродство фермента к субстрату.

Так как концентрация фермент-субстратного комплекса изменяется вслед­ствие перехода последнего в продукт реакции с регенерацией свободного фермента:

то значение K_s находят из соотношения констант скоростей прямой (k₊₁) и обратной (K+1) реакций, т. е.

К указанному выводу можно прийти, приравнивая скорости прямой и обрат­ной реакций, что характерно для равновесного состояния системы: v₁ = k₊₁ [E] [S]сли v₂ = v_2,то; k₊₁ [E] [S] = k_-1[ES] = k_-1 [ES], т. е. [E] [S] / [ES] = k_-1/k₊₁ = Ks.

Таким образом, субстратная константа, или константа диссоциации, фер­мент-субстратного комплекса (K_s) характеризует биокаталитический про­цесс с точки зрения сродства фермента и субстрата и соотношения кон­стант скорости реакций распада и становления фермент-субстратного ком­плекса.

Так как одновременно с диссоциацией фермент-субстратного комплекса на исходные вещества происходят превращения субстрата в продукт и распад комплекса фермент —продукт на составляющие его компоненты:

для полной характеристики ферментативного процесса введено понятие о кон­станте Михаэлиса (К_m), которая представляет отношение констант скоростей всех трех реакций, осуществляющихся в процессе ферментативного катализа: K_m = (k_-1 + k₊₂)/k₊₁. К_m всегда несколько выше по числовому значению, чем K_s. Так, К_s для комплекса сахаразы и сахарозы равно 0,0167М, а К_m составляет 0,0280М.

Скорость химической реакции, ускоряемой ферментом (как и скорость обычной химической реакции), измеряют количеством молей субстрата, пре­вращаемых в единицу времени. Однако принципиально важно, чтобы при этом поддерживались стандартные условия для проявления активности фермента: температура 25° С, оптимальное значение pH и, что особенно существенно, полное насыщение фермента субстратом. Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, обозначают V и называ­ют максимальной скоростью ферментативной реакции. Она определяется кон­центрацией фермента и константой скорости распада комплекса фермент-про­дукт: V = k_+2[Е].

Скорость ферментативной реакции, наблюдаемую при отсутствии пол­ного насыщения фермента субстратом, обозначают v. Она в каждый дан­ный момент пропорциональна концент­рации фермент-субстратного комплек­са: v = k₊₂[ES]. Так как [ES] = k₊₁/k_-1 = 1/K_s, т. е. [ES] = [E] [S] / K, то v = k₊₁, [E][S] / K_s.

Таким образом, наблюдаемая скорость ферментативной реакции зависит от концен­трации фермента и субстрата и их сродства. Численно Кm равна той концентрации суб­страта (в молях на литр), при которой V составляет 1/2V (рис. 48).

Концентрацию фермента и субстрата выражают обычно в микромолях на литр. Однако ввиду того, что точная молеку­лярная масса большинства ферментов и число каталитических (активных) цент­ров в их молекулах неизвестны, применя­ют условный способ выражения абсолют­ного количества фермента. За единицу любого фермента (обозначаемую на русск. и нем. Е, а на англ., франц., итал. и исп. U) принимают то его количество, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин. Эта величина (1 мкмоль/мин) является также единицей активности фермента. Указанная стан­дартная система обозначения количества фермента была введена в 1961 г. Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и прочно вошла в ферментологию. Ею пользуются и поныне. Как отмечено выше, согласно этой системе скорость ферментативной реакции выражали числом микромолей субстрата, превращаемых в 1 мин.

Рис. 48. Зависимость скорости фермента­тивной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента

В 1972 г., в связи с переходом на выражение скорости биокаталитических превращений в молях субстрата, преобразуемого в течение 1 с, было пред­ложено вместо старой, безымянной единицы ферментативной активности (Е или U) ввести новую единицу — катал (символ — кат), обозначающую количе­ство фермента, способное в течение 1 с обеспечить превращение 1 моля суб­страта (в стандартных условиях). Так как единица ферментативной активности в 1 кат, соответствующая скорости реакции 1 моль/с, мало реальна (превра­щения идут с гораздо меньшей скоростью), каталитическую активность в но­вой системе единиц выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) и пикокаталах (пкат), чему отвечают скорости реакций в микромолях, нано­молях и пикомолях в секунду соответственно. Старая единица (Е или U) равна 16,67 нкат. В течение ближайших лет предполагают осуществить переход на выражение ферментативной активности в каталах.

Концентрацию фермента в растворе в указанных единицах (Е) выражают числом их в 1 мл раствора. В случае сухого препарата фермента приводят данные о количестве Е на 1 мг. Если в препарате фермента определено содержание белка, то высчитывают удельную активность ферментного препа­рата, выражаемую числом Е на 1 мг белка. При наличии данных о числе Е в 1 мг чистого фермента говорят об удельной активности фермента. Если известна молекулярная масса фермента, то легко рассчитать число Е на 1 мкмоль его, т. е. молекулярную активность фермента. Следовательно, речь идет уже не о выражении концентрации фермента, а о выражении активности фермента либо числом микромолей субстрата, превращенных в 1 мин 1 мг фермента (удельная активность фермента), либо числом молекул субстрата, превращенных в 1 мин одной молекулой фермента (молекулярная актив­ность).

Если известно, сколько активных центров находится в молекуле фермента, активность его характеризуют числом молекул субстрата, превращенных при посредстве одного активного центра. Так, молекулярная активность каталазы равна 5 млн., тогда как активность ее каталитического центра (их в молекуле каталазы 4) составляет всего 1 млн. 250 тыс. молекул Н₂О₂.