Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Ферменты
Классификация ферментов и характеристика некоторых групп

По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолази, ускоряющие реакции негидролитического распада. Затем была сделана по­пытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы. 1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: А + В ⇄ С + D. 2. Ускоряющие превращения двух суб­стратов в прямой реакции и одного в обратной: А + В ⇄ С. 3. Обеспечиваю­щие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А ⇄ В.

Одновременно развивалось направление, где в основу классификации фер­ментов был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздей­ствию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции гидролиза (гидролазы), были изучены ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление в классификации ферментов оказалось наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших биохимиче­ских процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все ферменты делят на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы — ускоряют реакции окисления — восстановления. 2. Трансферази — ускоряют реакции переноса функциональных групп и моле­кулярных остатков. 3. Гидролазы — ускоряют реакции гидролитического рас­пада. 4. Лиазы — ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединя­ют группы атомов по двойной связи). 5. Изомеразы — ускоряют простран­ственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 6. Лигазы — ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энер­гией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.

1. Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катали­зирующие реакции окисления — восстановления. Общая схема их может быть представлена следующим образом:

Окисление протекает как процесс отнятия атомов Н (электронов) от суб­страта, а восстановление — как присоединение атомов Н (электронов) к акцеп­тору. Если обозначить акцептор буквой А, а субстрат — В, то уравнение реакции окисления — восстановления при участии оксидоредуктаз примет та­кой вид:

Характерной особенностью деятельности оксидоредуктаз в живой клетке является их способность образовывать системы (так называемые цепи окисли­тельно-восстановительных ферментов), в которых осуществляется многосту­пенчатый перенос атомов водорода или электронов от первичного субстрата к конечному акцептору, которым является, как правило, кислород, так что в результате образуется вода.

Те оксидоредуктазы, которые переносят атомы Н или электроны непосред­ственно на кислородные атомы, носят название аэробных дегидрогеназ или оксидаз. В отличие от них оксидоредуктазы, переносящие атомы Н и электро­ны от одного компонента окислительной цепи ферментрв к другому без передачи их на кислородные атомы называют анаэробными дегидрогеназами или редуктазами.

Если фермент катализирует реакцию отнятия Н непосредственно от окисляемого вещества (первичного субстрата), то его называют первичной дегидрогеназой. Если фермент ускоряет снятие водородных атомов со вто­ричного субстрата, который получил атомы Н при посредстве первичной дегидрогеназы (вторичным субстратом может быть кофермент самой пер­вичной оксидоредуктазы), его называют вторичной дегидрогеназой (см. гл. X).

Другая особенность оксидоредуктаз состоит в том, что, будучи двухком­понентными ферментами с весьма ограниченным набором активных групп (коферментов), они способны ускорять большое число самых разнообразных окислительно-восстановительных реакций. Это достигается за счет того, что один и тот же кофермент способен соединяться со многими апоферментами, образуя каждый раз оксидоредуктазу, специфичную по отношению к тому или иному субстрату или акцептору.

Еще одна, пожалуй, главная особенность оксидоредуктаз заключается в том, что они ускоряют протекание химических процессов, связанных с высвобождением энергии. Последняя используется как для обеспечения синтетических процессов в организме, так и для других нужд.

В природных объектах обнаружено около пятисот индивидуальных ок­сидоредуктаз. Наиболее распространены оксидоредуктазы, содержащие в ка­честве активной группы никотинамидадениндинуклеотид, или НАД⁺ (о строе­нии нуклеотидов см. гл. VI):

Более половины известных в настоящее время оксидоредуктаз содержат НАД⁺ в качестве кофермента. Соединяясь с тем или иным специфическим белком и образуя таким образом двухкомпонентный фермент, который сокращенно называют пиридинпротеином, НАД⁺ резко усиливает свою способность восстанавливаться по ядру никотинамида. В результате пиридин­протеины способны отнимать от субстратов (спирты, альдегиды, дикарбо­новые и кетокислоты, амины и др.) атомы Н в виде гидрид-ионов (Н~) и протонов (Н⁺), окисляя, таким образом, указанные соединения. Все пири­динпротеины являются анаэробными дегидрогеназами, т.е. не передают снятые с субстрата атомы водорода на кислород, а посылают их на ближай­ший в окислительной цепи другой фермент.

Рассмотрим строение и механизм действия одного из пиридинпротеинов — алкогольдегидрогеназы из печени животных. Это белок с М = 73000, состоя­щий из двух субъединиц, каждая из которых несет молекулу НАД⁺ и атом Zn. В процессе отнятия атомов Н от спирта образуется тройной апофермент-кофермент-субстратный комплекс, удерживаемый Zn²⁺, Строение этого ком­плекса и механизм реакции окисления спирта в альдегид представлены на рис. 53. Непосредственно к никотинамидадениндинуклеотиду от молекулы спирта переходит один атом водорода в виде гидридного иона (H⁺), т.е. атома водорода, несущего дополнительный электрон. Второй атом водорода, отнимаемый от молекулы спирта, наоборот, теряет электрон, превращаясь в протон (Н⁺), и поступает в реакционную среду. Поэтому уравнение реакции окисления спирта при участии НАД⁺ записывают так:

Рис. 53. Механизм действия алкогольдегидрогеназы

НАД* удерживается на поверхности белковой молекулы связями, возникающими между положительно заряженным атомом азота пиридинового цикла и отрицательно заряженным атомом серы (из HS-группы), а также между атомами азота пуринового цикла и атомом серы через посредство Zn²⁺. Молекула спирта присоединяется к активному центру фермента за счет координационной связи между атомом О и Zn²⁺. Каталитическую функцию в переносе атомов водорода от молекулы спирта к НАД⁺ выполняет имидазольный радикал гистидина. К пиридиновому ядру НАД⁺ присоединяется атом водорода, ранее находившийся в связи с атомом углерода, несущим спиртовую группу. Атом водорода спиртовой группы протонируется (І). Присоединение НАД⁺ к апоферменту происходит по нуклеотидсвязывающему домену (II), составленному из а-спиралей и ß-слоев. Структура нуклеотидсвязывающего домена близка у всех НАД-зависимых дегидрогеназ; к нижней части домена (ß-тяжи А, В и С) присоединяется фрагмент АМФ, а к верхней (ß-тяжи D, Е и F) — фрагмент никотинамидрибозофосфата молекулы НАД*

В любом случае НАД⁺ получает два электрона за счет присоединения гидридного иона (H).

Кроме НАД⁺ пиридинферменты содержат в качестве кофермента никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ⁺). Этот кофермент является произ­водным НАД⁺, у которого водород ОН-группы 2-го углеродного атома рибозы аденозина замещен на остаток фосфорной кислоты.

НАДФ⁺, соединяясь со специфическими белками, образует большую группу пиридинпротеинов, характеризующуюся своим набором субстратов. Механизм окисления при участии НАДФ⁺ в качестве кофермента аналогичен таковому при посредстве НАД⁺. Более того, НАДН и НАДФ⁺, равно как НАДФН и НАД⁺, при каталитическом участии специального фермента—трансгидрогеназы — способны обмениваться атомами водорода и электронами:

Партнером восстановленных форм пиридинпротеинов в оксидоредуктазной цепи, как правило, служат флавопротеины (ФП). Таким флавопротеином, например, является фермент, несущий в качестве активной группы фосфорилированный витамин В₂. Окисленная форма этого флавопротеина (М = 52000) окрашена. Каждая молекула фермента несет молекулу рибофлавинфосфата (или флавинмононуклеотида, ФМН), способного принимать и отдавать два атома Н по атомам N изоаллоксазинового кольца:

Другим коферментом в флавопротеинах является флавинадениндинуклеотид (ФАД):

ФМН и ФАД, соединяясь с различными апоферментами, дают начало приблизительно тридцати флавопротеинам, отличающимся различной специ­фичностью по отношению к субстратам.

Основная функция флавопротеинов — перенос электронов (атомов Н) от восстановленных пиридинпротеинов к другим компонентам окислительно­восстановительной цепи, т.е. ФП в большинстве случаев являются вторич­ными дегидрогеназами. Однако некоторые флавопротеины, особенно с ФАД в качестве кофермента, могут непосредственно снимать атом Н с субстрата.

Коферментами оксидоредуктаз являются также хиноны. Так, соединяясь с белком, убихиноны образуют убихинонпротеин, являющийся важной состав­ной частью ансамблей оксидоредуктаз, при посредстве которых осуществля­ется перенос атомов Н и электронов.

Убихиноны являются производными бензохинона и обладают боковой цепью, составленной из большого числа изопреноидных остатков:

Число изопреноидных фрагментов в боковой цепи (и) колеблется от б до 10. Установлено, что убихиноны принимают участие в окислительно-восстано­вительных процессах в организме, осуществляя передачу атомов Н:

В растениях эту функцию выполняет похожее на убихинон соединение — пластохинон:

Наиболее сложный, но и самый распространенный вариант окислительно­восстановительного процесса в клетке состоит в окислении атомов Н, снятых с субстрата, при посредстве цитохромной системы.

Цитохромную систему образуют несколько оксидоредуктаз, имеющих в ка­честве простетических групп железопорфирины (рис. 54). Еще в 1915 г., двадца­тью годами ранее О. Варбурга, на возможную роль железосодержащих белков в биологическом окислении обратили внимание А. Я. Данилевский и Б. П. Соловцов. Соединяясь с белками различного строения, железопорфирины 4 типов (А, В, С и D) дают начало семейству хромопротеинов, объединяемых под общим названием — цитохромы. Сейчас известно несколько десятков цитохромов, и список их непрерывно пополняется. Каждый индивидуальный цитохром обозначают строчной латинской буквой а, b, с и d с соответствующим порядко­вым индексом, например b₁, b₂, b₃ и т.д., а класс цитохрома — прописной латинской буквой А, В, С или D. Принадлежность цитохрома к определенному классу определяется строением простетической группы (железопорфирина), а окончательная индивидуальность — строением апофермента (белка). В послед­нее время предпочитают наряду с порядковым номером цитохрома указывать характерную длину волны, при которой отмечается поглощение в видимой части спектра (например, цитохром b₆ или b₅₆₃, найденный в хлоропластах, и т. п.).

Первичная структура ряда цитохромов выяснена: оказалось, что их видо­вая специфичность связана с небольшими различиями в чередовании амино­кислот. Эти данные принципиально важны для понимания природы видовой и иной специфичности ферментов: видимо, она определяется различиями прежде всего в первичной структуре апоферментов. Цитохромы b₁, b₂, b₃ и т. д., содержащие одну и ту же простетическую группу, отличаются Друг от друга именно по этому признаку.

Рис. 54. Строение цитохрома с из сердечной мышцы лошади

Простетическая группа цитохрома с представлена железопорфирином (с атомом Fe²⁺ в центре). Связь его с белком осуществля­ется за счет взаимодействия винильных радикалов гема с HS-группами 14-го и 17-го остатков цистеина полипептидной цепи. Аминогруппа N-концевого глицина ацетилирована. На объемной модели цитохрома с цифрами указаны номера аминокислотных остатков, каждый из которых также представлен пространственной структурой

На рис. 54 приведена структура цитохрома с из сердца лошади. Молеку­лярная масса цитохрома с невелика — порядка 13 000. При увеличении в 1 млн. 300 тыс. раз (электронная микроскопия) видно, что полипептидная цепь цито­хрома с свернута в ос-спираль длиной в 12—15 нм, которая, в свою очередь, закручена в спираль второго порядка с диаметром в 4—5 нм, так что группа гема оказывается изолированной внутри обвивающей ее полипептидной цепи. Кольцеообразные молекулы легко образуют более крупные агрегаты. Строе­ние остальных цитохромов изучено менее детально. Однако известно, что молекулярные массы некоторых из них более высоки. Способность агрегировать друг с другом, по-видимому, одно из свойств, присущих молекулам цитохромов.

Именно поэтому цитохромы образуют цитохромную систему, представ­ляющую собой упорядоченное сочетание в едином комплексе различных цитохромов, например b, с и а.

Цитохромная система способна принимать электроны, снятые с атомов Н восстановленного убихинона (УХ). Она передает электроны далее по цепи цитохромов и, наконец, на кислородный атом; последний, соединяясь с иони­зированными атомами Н, образует молекулу Н₂O.

В цепи цитохромов каждый из индивидуальных цитохромов занимает строго определенное место. Простейший вариант цитохромной системы при­веден на следующей схеме:

Как видно из схемы, передача электронов в цитохромной цепи осуществ­ляется за счет изменения валентности атома Fe порфиринового ядра. Из всех цитохромов только цитохром с, а₃ передает электроны на кислород. Поэтому именно он завершает цепь цитохромов и носит название цитохромоксвдазы. Кроме атомов Fe (в составе гема) цитохром а, а3 содержит также атомы Сu, с которыми связывают его окислительные свойства (см. гл. X, рис. 132).

Таковы характерные черты действия некоторых важнейших оксидоредуктаз и окислительно-восстановительных систем, обеспечивающих превращение ря­да веществ в клетке.

2. Трансферази. В этот класс входят ферменты, ускоряющие реакции пере­носа функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. Это один из наиболее обширных классов: он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера переносимых груп­пировок различают фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и др.

Фосфотрансферазы. Сюда относятся ферменты, ускоряющие реакцию пере­носа остатка фосфорной кислоты. Эта реакция имеет исключительно важное значение для жизнедеятельности организма, обеспечивая превращение ряда органических соединений в фосфорные эфиры, обладающие повышенной хими­ческой активностью и более легко вступающие в последующие реакции. Перенос фосфатных групп идет на спиртовые, карбоксильные, азотсодержащие, фосфор­содержащие и другие группы тех или иных органических соединений. В соот­ветствии с этим среди фосфортрансфераз различают несколько подподклассов.

Донором фосфатных остатков является в большинстве случаев аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), но возможны и другие их источники. К фосфотрансферазам относится, например, гексокиназа — фермент, ускоряющий пере­нос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к глюкозе (с этой реакции обычно начинается преобразование глюкозы):

Гексокиназа распространена повсеместно. Особенно хорошо изучена гексокиназа дрожжей. Ее молекула (М = 96 000) составлена из 4 субъединиц. Муль­тимер устойчив при pH 5. При снижении или повышении pH раствора моле­кула гексокиназы распадается на 4 протомера (М = 24 000), лишенных фосфо- трансферазной активности. В соответствии с двойственной природой субъединиц в мультимерах обнаружено 5 изозимов гексокиназы.

Преобразование многих других моносахаридов тоже начинается с их фос­форилирования при посредстве фосфотрансфераз: так обстоит дело в случае ß- D-фруктозы, ß-D-рибозы (см. с. 338) и ряда других сахаров.

Особое внимание в последнее время уделяют изучению фосфотрансфераз, обеспечивающих перенос остатка фосфата с АТФ на белки, — протеинкиназам. Они переносят фосфат на радикалы сер, тре, тир, лиз и гис ряда белков, в результате чего резко изменяется биологическая активность последних. Это, в свою очередь, сказывается на интенсивности протекания химических процес­сов в организме, т. е. на регуляции обмена веществ (см. гл. XIII).

Аминотрансферазы. Эти ферменты ускоряют реакцию переаминирования аминокислот с кетокислотами и очень важны для обеспечения биосинтеза аминокислот. Аминотрансферазы двухкомпонентны: простетической группой их во всех случаях является пиридоксальфосфат, ковалентно присоединенный к апоферменту через свою альдегидную группу (см. рис. 55, Б) и ионной связью — через остаток фосфорной кислоты:    

Механизм реакции переаминирования сейчас хорошо выяснен, а сама реакция открыта еще в 1937 г. А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман.

Для удобства пиридоксальфермент обозначим при помощи следующей структуры: сохранив только функционально значимую альде­гидную группу его кофермента.

На. первой стадии ферментативного катализа простетическая группа фермента (для простоты принято, что она свободна, а не соединена альдиминной связью с апоферментом через Б-аминогруппу радикала лиз) взаимодей­ствует с аминокислотой, подвергающейся переаминированию. Реакция идет по аминогруппе аминокислоты и альдегидной группе остатка пиридоксальфосфата:

На второй ступени катализа идет преобразование субстрата, выражающее­ся в данном случае в таутомерной перегруппировке:

Эта перегруппировка осуществляется при участии имидазолсодержащих радикалов остатков гис, входящих в состав каталитического центра фермента:

В результате последующего гидролиза освобождаются кетокислота и фер­мент в виде пиридоксаминофермента:

Далее между пиридоксаминоферментом и другой кетокислотой вновь воз­никает фермент-субстратный комплекс:

Субстрат в нем снова подвергается преобразованию за счет таутомерного превращения:

Полученное соединение гидролизируется, и возникает новая аминокислота:

Следовательно, в результате серии реакций, включающих в себя попе­ременное образование фермент-субстратных комплексов, аспарагиновая кислота переходит в щавелевоуксусную, а а-кетоглутаровая — в глутаминовую. Это выражается следующим суммарным уравнением:    

Центральную роль в пиридоксалевом катализе играет смещение электрон­ной плотности в фермент-субстратном комплексе:

В результате у а-углеродного атома аминокислотного остатка ослабляют­ся связи с заместителями (азотом, СООН-группой и др.), вследствие чего легко осуществляется разрыв соответствующих связей.

Аспартатаминотрансфераза имеет молекулярную массу, равную 93000, и состоит из двух идентичных субъединиц (М = 46 500), каждая из которых соединена с молекулой пиридоксальфосфата. При разбавлении растворов аспартатаминотрансферазы ее димеры распадаются на каталитически активные мономеры. Благодаря исследованиям главным образом советских ученых (А. Е. Браунштейна с сотр., Ю. А. Овчинникова с сотр. и Б. К. Вайнштейна с сотр.) выяснены первичная и третичная структуры этого фермента, строение и детальный механизм функционирования его активного центра. Субъединица цитозольного изофермента аспартатаминотрансферазы из сердца свиньи (дру­гой изофермент локализован в митихондриях) представлена полипептидной цепью из 412 аминокислотных остатков. Значительная часть ее находится в а-спиральной конформации, а в обособленном участке глобулы расположен коферментсвязывающий домен, где локализован активный центр (рис. 55). Характерно, что коферментсвязывающий домен пиридоксальферментов очень похож на нуклеотидсвязывающий домен НАД⁺- и НАДФ⁺-зависимых дегид­рогеназ (см. рис. 53, II), что объясняется, видимо, присутствием пиридинового цикла в составе того и другого кофермента.

Поскольку аспартатаминотрансфераза состоит из двух субъединиц и несет, следовательно, два остатка пиридоксальфосфата, в реакции переаминирования субъединицы работают согласованно, со сдвигом по фазе в использовании энергии, необходимой для осуществления химических преобразований; вслед­ствие этого димерная структура фермента дает существенный выигрыш в осу­ществлении каталитического процесса.

Рис. 55. Один из возмож­ных вариантов третичной структуры аспартатамино­трансферазы (А) и строе­ние ее активного центра (Б)

На рис. Б видно, что пиридоксальфосфат соединен альдиминной связью с Е-аминогруппой остатка лизина в апоферменте; именно по этой альдиминной связи присоеди­няется аминогруппа аминокисло­ты, вытесняя оттуда ε-аминогруппу лизина

Гликозилтрансферазы. Эти ферменты ускоряют реакции переноса гликозильных остатков из молекул фосфорных эфиров или других соединений к молекулам моносахаридов, полисахаридов или иных веществ, обеспечивая главным обра­зом реакции синтеза и распада олиго- и полисахаридов в животном и раститель­ном мире. Ниже приведено уравнение реакции распада сахарозы при участии сахароза: ортофосфат-а-глюкозилтрансферазы, или сахарозофосфорилазы:

Аналогично этому действуют крахмалфосфорилаза, гликогенфосфорилаза и другие гликозилтрансферазы. В случае переноса гликозильных остатков на Н3РО4 этот процесс называют фосфоролизом, так как он формально аналоги­чен гидролизу, но вместо элементов воды по месту разрыва кислородного мостика присоединяются водород и фосфатная группа фосфорной кислоты (подробнее о гликогенфосфорилазе и механизме ее действия см. гл. VIII).

В последнее время выяснено, что перенос гликозильных остатков особенно легко осуществляется ферментами данной группы в тех случаях, когда суб­стратом служит нуклеозиддифосфатмоносахарид. Эта реакция представляет, видимо, основной путь природного синтеза олиго- и полисахаридов и будет детально рассмотрена в гл. VIII. Нуклеозиддифосфатсахара являются коферментами гликозилтрансфераз.

Ацилтрансферазы. Эти ферменты ускоряют перенос ацилов (остатков карбо­новых кислот) на аминокислоты, амины, спирты и другие соединения. Уни­версальным источником ацильных групп во всех этих реакциях является ацил-коэнзим А, который с полным основанием можно рассматривать как активную группу ацилтрансфераз.

Чаще всего переносу в биологических объектах подвергается ацил уксусной кислоты — ацетил

Коэнзим А (см. формулу на с. 163), соединяясь с ацетильным остатком, кото­рый занимает место водорода в его HS-группе, образует ацетил-коэнзим А. Последний служит кофактором в соответствующей реакции переноса. Одним из примеров реакции трансацилирования является синтез ацетилхолина:

Важное значение среди трансфераз имеют ферменты, ускоряющие перенос одноуглеродных фрагментов (метальных, оксиметильных, формильных и т. п.), а также нуклеотидилтрансферазы, катализирующие перенос нуклео­тидных остатков в процессе синтеза нуклеиновых кислот. Механизм их дей­ствия будет описан ниже.

3. Гидролазы. К классу гидролаз относят ферменты, ускоряющие реакции расщепления (а иногда и синтеза) органических соединений при участии воды: R'R"+HOH ⇄ R'H+R"OH. В зависимости от характера субстрата, подвергающе­гося гидролизу, гидролазы делят на ряд подклассов, среди которых наиболее важны следующие:

1) эстеразы, ускоряющие реакции гидролиза сложных эфиров;

2) гликозидазы, ускоряющие реакции гидролиза гликозидов, в том числе углеводов;

3) пептид-гидролазы, ускоряющие реакции гидролиза (а в особых случаях и синтеза) белков, пептидов и других соединений, содержащих пептидные связи;

4) гидролазы, действующие на С—N-связи, отличающиеся от пептидных (например, амидазы и т. п.). Всего в составе гидролаз насчитывают почти 500 ферментов.

Эстеразы. Эти ферменты катализируют реакции гидролиза сложных эфи­ров спиртов с органическими и неорганическими кислотами. Важнейшими подподклассами эстераз являются гцдролазы эфиров карбоновых кислот и фос­фатазы. В качестве представителя первого подподкласса рассмотрим липазу.

Липаза ускоряет гидролиз внешних, т. е. а-сложноэфирных, связей в моле­кулах триацилглицеринов (жиров):

Механизм действия ряда эстераз детально изучен. Один из примеров рассмотрен в этой главе (см. раздел о механизме действия ферментов). Харак­теристика липаз дана в гл. IX.

Фосфатазы катализируют гидролиз фосфорных эфиров. Особенно широко распространены фосфатазы, действующие на сложные эфиры фосфорной кис­лоты и углеводов, например глюкозо-1-фосфатаза:

Действие фосфатаз проявляется в широком спектре pH от 3 до 9. Большин­ство из них обладает широкой субстратной специфичностью. Особенно важны для регуляции процессов жизнедеятельности протеинфосфатазы, обеспечиваю­щие отщепление фосфата от фосфорилированных белков, вследствие чего изменяется их биологическая, в частности ферментативная, активность.

Гликозидазы. Эти ферменты ускоряют реакцию гидролиза гликозидов. В зависимости от того, на какой пространственный изомер (а или ß) действует фермент, его относят к а- или ß-гликозидазам. Таким образом, гликозидазы обладают ярко выраженной пространственной специфичностью. Кроме гликозидов, содержащих в качестве агликонов остатки одноатомных спиртов, суб­стратами, на которые распространяется действие тех или иных гликозидаз, являются олиго- и полисахариды. Из действующих на олигосахариды глико­зидаз упомянем мальтазу (а-гликозидаза) и сахаразу (ß-гликозидаза). Они ускоряют соответственно гидролиз мальтозы и сахарозы:

Из гликозидаз, действующих на полисахариды, наиболее известны амилазы. В природе существует несколько видов амилаз, ускоряющих реакции гидролиза гликозидных связей в молекуле крахмала с образованием глюкозы, мальтозы или олигосахаридов. Их характеристика и механизм действия рассмотрены в гл. VIII.

Гидролиз других природных полигликозидов: целлюлозы, инулина, ксилана и т. п. — также ускоряется соответствующими гликозидазами. Некоторые гликозидазы катализируют также реакции переноса гликозильных остатков, т. е. являются трансгликозидазами.

Пептид-гидролазы. Ферменты этого подкласса ускоряют гидролиз пептид­ных связей в белках и пептидах, а при определенных условиях также и об­разование пептидных связей, хотя этот путь синтеза белка не является физио­логическим. Химизм процесса гидролиза белков и пептидов при участии пептидгидролаз можно выразить следующей схемой:

Среди пептид-гидролаз различают протеиназы или пептидил-пептидогидролазы, катализирующие гидролиз небольшого числа внутренних пептидных связей в белковой молекуле, в результате чего последняя распадается до пептидов. Они являются, следовательно, эндопептидазами. В отличие от этого пептид-гидролазы, называемые пептидазами, обеспечивают отщепление от пептидной цепи свободных аминокислот, будучи экзопептидазами.

Протеиназы в зависимости от механизма их действия на внутренние пеп­тидные связи в белковой молекуле делят на 4 подподкласса: 1) сериновые протеиназы, несущие в активном центре радикалы сер и гис, обеспечивающие осуществление каталитического акта; представителями их являются химотрипсин и трипсин, выделяемые поджелудочной железой, субтилизин, продуциру­емый бактериями, и др.; 2) тиоловые (цистеиновые) протеиназы, имеющие в активном центре остаток цис; к их числу принадлежат папаин из латекса дынного дерева Carica papaya, фицин из латекса фикуса, бромелаин из сока ствола ананаса, катепсин В — внутриклеточный фермент позвоночных и др.; 3) кислые (карбоксильные) протеиназы, имеющие оптимум pH ниже 5 и содер­жащие радикалы дикарбоновых аминокислот в активном центре; сюда отно­сятся пепсин, выделяемый слизистой желудка, катепсин D, характеризующий­ся внутриклеточной локализацией, и ряд кислых протеиназ, продуцируемых разнообразными микроорганизмами; 4) металлопротеиназы, каталитическое действие которых зависит от присутствия ионов металлов (Са²⁺, Zn²⁺) в ак­тивном центре; примерами их могут служить коллагеназа и ряд протеиназ микробного происхождения (термолизин, компонент проназы и др.).

Пепсин, трипсин и химотрипсин выделяются железистыми клетками в виде неактивных проферментов — зимогенов: пепсиногена, трипсиногена и химотрипсиногена, так как их активные центры блокированы фрагментами полипеп­тидной цепи, после гидролитического отщепления которых фермент приоб­ретает активность. Это явление впервые было открыто в лаборатории И. П. Павлова.

Очень важной особенностью протеиназ является выборочный (селективный) характер их действия на пептидные связи в белковой молекуле. Так, пепсин избирательно ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных фен и лей; трипсин — арг и лиз; химотрипсин — ароматическими аминокислотами; папа­ин — арг, лиз и фен и т. д. В результате индивидуальный белок под действием определенной пептидил-пептидогидролазы расщепляется всегда на строго ограниченное число пептидов. Это находит практическое использование при определении первичной структуры белков и имеет огромное значение для регуляции обмена веществ, так как многие продукты селективного гидролиза белков обладают высочайшей биологической активностью: именно этим путем из проферментов возникают ферменты, из предшественников гормо­нов — гормоны и рилизинг-факторы и т. п. Причина избирательного действия пептидпептидогидролаз заключается в том, что радикал аминокислоты, по соседству с которой гидролизуется пептидная связь, служит для образования фермент-субстратного комплекса.

Пептид-гидролазы, катализирующие гидролиз пептидов до свободных аминокислот, могут отщеплять последние от пептида, начиная либо с амино­кислоты, обладающей свободной NН₂-группой, либо с аминокислоты, име­ющей свободную COOH-группу. В первом случае их называют аминопеп­тидазами (а-аминоацилпептид-гидролазы), во втором — карбоксипептидазами (пептидиламиноацидо-гидролазы).

Схема, поясняющая действие амино- и карбоксипептидаз, а также некото­рых эндопептидаз, приведена на рис. 56.

Некоторые амино- и карбоксипептидазы обладают специфичностью дей­ствия, т. е. отщепляют строго определенные N- или С-концевые аминокисло­ты. Третий подподкласс пептидаз представлен дипептид-гидролазами, или дипептидазами. Их известно около десяти. Они завершают гидролиз белка. Недавно из состава пептидаз вычленено еще два подподкласса: дипептидилпептидгидролазы, отщепляющие от N-конца полипептида дипептид, и пептидилдипептид-гидролазы, отщепляющие дипептид с С-конца.

Амидазы. Эти ферменты ускоряют гидролиз амидов кислот. Из них важ­ную роль в биохимических процессах в организме играют уреаза, аспарагиназа и глутаминаза.

Рис. 56. Точки приложения действия протеолитических ферментов на пептидные связи в белковой молекуле

Уреаза была одним из первых белков-ферментов, полученным в кристал­лическом состоянии (Д. Самнер, 1926). Это однокомпонентный фермент (М = 480 000); молекула его глобулярна и состоит из 8 равных субъединиц. Уреаза ускоряет гидролиз мочевины до NH₃ и СО₂.

Аспарагиназа и глутаминаза ускоряют гидролиз амидов дикарбоновых амино­кислот — аспарагиновой и глутаминовой, например:

К гидролазам, действующим на С—N-связи, отличающиеся от пептидных, кроме амидаз относятся ферменты, катализирующие гидролиз С—N-связей в линейных амидинах. К их числу принадлежит аргиназа. При посредстве аргиназы аминокислота аргинин гидролизуется на орнитин и мочевину:

Так как в процессе гидролиза аргинина отщепляется мочевина, то системати­ческое название аргиназы — L-аргинин-уреогидролаза. Эта реакция широко пред­ставлена в природе, являясь заключительной стадией биосинтеза мочевины — одного из конечных продуктов распада азотсодержащих веществ. Для аргиназы, как и для уреазы, характерна абсолютная специфичность действия.

4. Лиазы. К классу лиаз относятся ферменты, ускоряющие негидролитичес­кие реакции распада органических соединений по связям С—С; С—N; С—О и т. д. При этом замыкаются двойные связи и выделяются такие простейшие продукты, как СО₂, Н₂О, NH₃ и т. п. Некоторые из этих реакций обратимы, и соответствующие ферменты в подходящих условиях катализируют реакции не только распада, но и синтеза. Таким образом, название этого класса ферментов не всегда соответствует содержанию тех процессов, которые ими ускоряются.

Одной из важнейших групп ферментов этого класса являются углерод-углерод-лиазы (С—С-лиазы). Среди них особое значение имеют карбоксилиазы (декарбоксилазы) и альдегид-лиазы.

В природе широко распространены декарбоксилазы кетокислот и амино­кислот, катализирующие реакции по следующим схемам:

Эти ферменты двухкомпоненты, простетическими группами их во многих случаях являются фосфорные эфиры водорастворимых витаминов: тиамина (B1) — в карбокси-лиазах кетокислот и пиридоксаля (В₆) — в карбокси-лиазах аминокислот.

Механизм реакции декарбоксилирования кетокислот при участии декарбокси­лаз с тиаминпирофосфатом в качестве кофермента будет рассмотрен в гл. IV. Механизм реакции декарбоксилирования аминокислот с помощью карбокси-лиазы с пиридоксальфосфатом в качестве кофермента очень близок к тому, который действует при переаминировании аминокислот. Здесь тоже возникает шиффово основание, в котором электронная плотность у а-углеродного атома аминокислоты резко ослаблена. Вследствие этого сильно ослабляется связь этого углеродного атома с карбоксильной группой, и последняя легко отщепляется.

Характерным представителем альдегид-лиаз является альдолаза, катализирую­щая обратимую реакцию расщепления фруктозо-1,6-дифосфата до фосфотриоз:

Эта реакция занимает центральное место в преобразовании углеводов. Аналогично альдолазе действуют другие альдегид-лиазы.

Другую важную группу лиаз составляют углерод — кислород лиазы (гидро-лиазы), ускоряющие реакции гидратирования и дегидратирования органиче­ских соединений. В качестве представителя гидро-лиаз приведем фумаратгидратазу:

Реакции гидратирования и дегидратирования постоянно идут при распаде и синтезе углеводов и высших жирных кислот, поэтому гидратазы играют большую роль в жизнедеятельности организмов.

Примером углерод — азот лиаз может служить аспартат — аммнак-лиаза, ускоряющая реакцию прямого дезаминирования аспарагиновой кислоты:

Этот фермент характерен для бактерий и ряда растений.

Некоторые лиазы ускоряют реакции не только распада, но и синтеза. Например, из дрожжей выделена L-серин-гидро-лиаза, отщепляющая от серина воду и присоединяющая сероводород, в результате чего синтезируется амино­кислота — цистеин:

Чтобы отличить такие лиазы от ферментов класса лигаз (которые ускоря­ют реакции только синтеза и именуются в связи с этим синтетазами), их называют также синтазами.

5. Изомеразы. Ферменты, относящиеся к этому немногочисленному (около 90 индивидуальных ферментов) классу, ускоряют геометрические или струк­турные изменения в пределах одной молекулы. Эти изменения могут состоять во внутримолекулярном переносе водорода, фосфатных и ацильных групп, в изменении пространственного расположения атомных группировок, в пере­мещении двойных связей и т. п.

Важнейшими изомеразами являются триозофосфатизомераза, фосфоглицерат-фосфомутаза, альдозомутаротаза и изопентенил-пирофосфатизомераза.

Триозофосфатизомераза ускоряет перенос атомов Н в процессе превращения 3-фосфоглицеринового альдегида в фосфодиоксиацетон и обратно:

Превращение, вероятно, идет через общую эндиольную форму. Фосфоглицерат-фосфомутаза обеспечивает достаточную скорость превраще­ния 2-фосфоглицериновой кислоты в 3-фосфоглицериновую кислоту и обратно:

Оба процесса имеют громадное значение в органическом мире, так как представляют важнейшие стадии распада и синтеза углеводов.

Мутаротаза является представителем стереоизомераз, она ускоряет реак­цию превращения a-D-глюкопиранозы в ß-D-глюкопиранозу:

Ферменты этого типа (стереоизомеразы) обеспечивают, в частности, вза­имопревращения многих пространственных изомеров моносахаридов, и этот путь является иногда единственным для синтеза некоторых из них в природе. К стереоизомеразам относятся также цис-трансизомеразы, например ретинол-изомераза, переводящая транс-ретинол в цис-ретинол (см. гл. IV).

Изопентенилпирофосфат-изомераза катализирует реакцию перестройки изопентенилпирофосфата в диметилаллилпирофосфат, что связано с перемещени­ем двойной связи из 3-го во 2-е положение:

Изопентенилпирофосфат-изомераза содержит свободные сульфгидрильные группы, вероятно, в виде радикалов цис в белковой молекуле. Именно благо­даря им обеспечивается указанная выше реакция, имеющая огромное значение для синтеза полиизопреноидов и стеролов.    

6. Лигазы (синтетазы). Характерные черты действия ферментов этого клас­са выявлены совсем недавно в связи со значительными успехами в изучении механизма синтеза жиров, белков и углеводов. Оказалось, что старые пред­ставления об образовании этих соединений, согласно которым они возникают при обращении реакций гидролиза, не соответствуют действительности. Пути их синтеза принципиально иные.

Главная их особенность — сопряженность синтеза с распадом веществ, спо­собных поставлять энергию для осуществления биосинтетического процесса. Одним из таких природных соединений является АТФ. При отрыве от ее молекулы в присутствии лигаз одного или двух концевых остатков фосфорной кислоты выделяется большое количество энергии, используемой для активи­рования реагирующих веществ. Лигазы же каталитически ускоряют синтез органических соединений из активированных за счет распада АТФ исходных продуктов. Таким образом, к лигазам относятся ферменты, катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофос­фатной связи в молекуле АТФ или иного нуклеозидтрифосфата.

Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом рас­падающейся молекулы АТФ, а вслед за этим указанный промежуточный продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции с образованием конечного продукта.

В качестве примера действия лигазы можно привести синтез пантотеновой кислоты из а, у-диокси-ß, ß-диметилмасляной кислоты и ß-аланина:

Пантотеиатсинтетаэа, как следует из приведенного уравнения, относится к группе лигаз, ускоряющих реакции синтеза С—N-связей. Эта группа лигаз насчитывает около 40 представителей. В настоящее время изучено более 75 различных лигаз, обеспечивающих важнейшие синтетические процессы в жи­вотной и растительной клетках.

Кроме ускорения реакций синтеза С—N-связей, в частности пептидных, лигазы катализируют образование связей С—С, С—О и С—S. К группе лигаз, образующих С—С-связи, относятся карбоксилазы. Они обеспечивают карбоксилирование ряда соединений, в результате чего происходит удлинение угле­родных цепей. Одной из важнейших карбоксилаз является пируваткарбоксилаза, ускоряющая реакцию образования щавелевоуксусной кислоты из пи­ровиноградной кислоты и оксида углерода (IV):

Эта реакция имеет исключительное значение в обмене веществ, обеспечи­вая взаимосвязь обмена углеводов и белков и акцептирование СО₂.

Лигазам, катализирующим синтез С—О-связей, принадлежит важнейшая роль в биосинтезе белков, так как они ускоряют реакции активирования аминокислот перед вступлением последних в пептидную связь. Одной из простейших реакций этого типа является образование аминоациладенилатов:

С аминоациладенилатов аминокислоты передаются на тРНК, образуя аминоацил-тРНК, используемые непосредственно при синтезе полипептидов. Эти процессы будут детально рассмотрены в гл. VII.

Лигазы, кроме того, осуществляют ускорение реакций образования С—S-связей, являясь ацил-коэизим А-синтетазами. В качестве примера действия ацил-коэнзим А-синтетазы можно привести образование ацетил-коэнзима А из уксусной кислоты и коэнзима А (см. формулу на с. 163), протекающее сопряженно с распадом АТФ:

Ацетил-КоА служит коферментом в реакциях трансацилирования, поэтому действие ферментов этих двух групп — лигаз и ацилтрансфераз — в живых системах тесно увязано друг с другом. Аналогичная взаимозависимость харак­терна и для многих других ферментов.