Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Ферменты
Применение ферментов

Ферменты способны осуществлять свою каталитическую функцию и вне клетки, вне организма. Хотя, находясь с составе соответствующих структур, ферменты обладают огромной мощностью действия, тем не менее, будучи выделены из биологических объектов, они сохраняют свою каталитическую активность. Естественно, что ряд ферментных препаратов используют в практике.

Практическое применение ферментов в народном хозяйстве нашей страны расширяется с каждым годом. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты (содержат амилазу и протеиназу), выделяемые из грибов, относящихся к роду Aspergillus. Будучи добавлены в количестве 20—25 г на 1 т муки, они улучшают качество и аромат хлеба, ускоряют созревание теста на 30%, сокращают расход сахара на производство высших сортов булочных изделий вдвое, увеличивают пористость мякиша и объем хлеба на 20%.

В пивоварении и спиртовой промышленности применяют амилазы — фермен­ты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. Их производство приняло у нас промышленный характер. Экономический эффект применения амилаз весьма значителен. Так, в пивоварении использование ферментных препаратов позволяет экономить 165 г ячменя при производстве каждого декалитра пива. Применение амилазы при производстве спирта дает возможность полностью отказаться от зернового солода и одновременно увеличить выход спирта из сырья на 1,5% при снижении себестоимости декалитра спирта. Широкие перспективы сулит использование ферментов в виноделии. Пектинолитические ферменты повышают выход соков из плодов и ягод на 15—20%, виноматериалов — на 5—7%; они также необходимы для осветления фруктовых соков. Каталаза и глюкозооксидаза длительно сохраняют букет розовых и белых вин.

В кожевенном н меховом производстве для ускорения снятия волоса со шкур и размягчения кожевенного сырья применяют препараты протеиназ (протелин и протофрадин), являющихся внеклеточными протеиназами стрептомицетов. При этом время на осуществление необходимых процессов сокращается в не­сколько раз, сортность и качество шерсти и кож повышается, а условия труда в этой отрасли производства резко улучшаются. В текстильной промышлен­ности процесс расшлихтовки тканей ферментными препаратами грибного и бактериального происхождения ускоряется в 7—10 раз; эти же препараты служат для удаления серицина при размотке коконов тутового шелкопряда в производстве натурального шелка. В кулинарии применение пептидгидролаз (протелин и проназа) для обработки мяса перед его приготовлением резко улучшает качество мясных блюд. В мясной промышленности протеолитические ферменты применяют для ускорения созревания мяса и повышения выхода мяса 1-го сорта с 15 до 40%. В молочной промышленности использование протеаз ускоряет созревание сыров вдвое и снижает их себестоимость на 10%. Подсчеты показывают, что если полностью обеспечить кожевенную, пищевую и текстиль­ную промышленность ферментными препаратами (их потребуется несколько тысяч тонн в год), то за счет этого можно получить значительную экономию.

Ферменты применяют и в бытовой химии. Протеазы растительного проис­хождения, выдерживающие нагревание до 90° С без заметной потери актив­ности, являются компонентами стиральных порошков и моющих средств. В стиральные порошки вводят также а-амилазу, глюкозооксидазу и липоксигеназу, а уратоксидаза в составе моющих средств способствует удалению винных и жирных пятен с одежды. Глюкозооксидазу, каталазу и некоторые другие ферменты добавляют в зубную пасту—они обеспечивают их антимик­робные свойства и предохранение зубов от кариеса.

Крупномасштабным является производство глюкозы из отходов целлюло­зы при посредстве целлолитического комплекса ферментов и из крахмала при помощи глюкоамилазы. Обработка дигестазой (комплекс протеолитических ферментов, выделяемый из печени крабов) повышает на 3.0% выход товарного продукта при обработке икры, извлеченной из рыб.

Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу в виде ферментных препаратов и их смесей (бетацид, абомин, фестал, панзинорм и др.) применяют для лечения заболева­ний желудочно-кишечного тракта. Гиалуронидазу (у нас выпускают два ее препарата, выделяемых из семенников быка, — лидазу и ронцдазу), деполимеризующую гиалуроновую кислоту и способствующую проникновению лекарствен­ных средств в пораженную ткань — для лечения заболеваний суставов, отеков, ран, кровоподтеков и т. п. Протеолитические ферменты — плазмин (фибриноли­зин) и активирующие его стрептокиназу и урокиназу — для растворения тром­бов в кровеносных сосудах. Дезоксирибонуклеазу из поджелудочной железы или стрептококка (стрептодорназа) — для лечения заболеваний верхних дыхатель­ных путей и роговицы глаза, а также для удаления гноя из ран. Аспарагиназу, обеспечивающую дезамидирование аспарагина, незаменимого для роста ряда опухолей, — при лечении некоторых видов рака. Лизоцим — для лечения конъюн­ктивитов, цитохром — для устранения явлений кислородного голодания при заболеваниях сердца, коллагеназу — для рассасывания рубцовых образований, эластазу — для задержки развития атеросклероза, ß-галактозидазу — для снятия явления непереносимости молочных продуктов из-за недостаточности этого фермента в пищеварительном тракте ряда людей, галактокиназу — для выведе­ния галактозы из тканей при ее патологическом накоплении в них, L-фенилаланин-аммиак-лиазу — для понижения содержания в крови фенилаланина при нарушениях его обмена, лизоамидазу — для лечения заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами (стафилококки, стрептококки и др.).

Специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика: заболевание того или иного органа у человека может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношению его множест­венных форм (в том числе изозимов) в крови или реже в моче. Так, лактатдеги­дрогеназа (ЛДГ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), креатинкиназа, изоцит­ратдегидрогеназа и фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза служат для диагноза инфаркта миокарда; ЛДГ, АсАТ и аланинаминотранефераза — заболевания светлыми кружками и тонкой цветной ли­нией обозначен ход кривой, отражающей ежегодные публикации по изучению иммо­билизованных ферментов, темными и тол­стой цветной линией — число получаемых ежегодно патентов печени, у-глутамилтрансфераза — отторжения ор­ганов при их пересадке, щелочная фосфатаза — заболевания желтухой, кислая фосфатаза — нару­шения функции предстательной железы и т. д.

Рис. 57. Развитие работ по ин­женерной энзимологии:

Особенно широко в последние годы процессы ферментации применяют в химической промыш­ленности. Использование ферментов для произ­водства тех или иных химических продуктов ста­ло массовым явлением. Для этого в большинстве случаев применяют иммобилизованные ферменты, т. е. ферменты, закрепленные на носителе, но сохранившие каталитическую активность, что по­зволяет использовать их повторно или непре­рывно.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин пока­зали, что ферменты в водонерастворимой форме сохраняют каталитическую активность, однако первая попытка получить иммобилизованные фер­менты с целью их практического применения была предпринята только в 1953 г. Н. Ірубхофером и Л. Шлейтом, закрепившими на диазотирован­ном полиаминополистироле амилазу, пепсин, рибонуклеазу и карбоксипептидазу. В течение последующих 12 лет исследования в этой области были единичны­ми и только начиная с 1965 г. приобрели широкий, а с 1971 г., после проведения первой конференции по инженерной энзимологии, массовый характер (рис. 57).

Для промышленных целей иммобилизуют ферменты в основном микробно­го происхождения ввиду их доступности, дешевизны (они в 100 раз дешевле, чем ферменты животного и растительного происхождения), независимости массового производства от сезона вегетации растений или сроков выращива­ния животных, короткого периода накопления бактериальной массы для выде­ления ферментов. Важно, что иммобилизация, как правило, сопровождается повышением в тысячи и десятки тысяч раз стабильности ферментов, что создает условия для их использования в качестве гетерогенных катализаторов. Кроме того, механическое изменение матрицы, на которой закреплен фермент, открывает возможность варьировать его активность и понять принцип работы природных механохимических систем.

Сейчас все более отчетливо вырисовывается огромное значение иммобили­зации ферментов для осуществления процессов жизнедеятельности, ибо значи­тельная часть их в клетке иммобилизована сепаратно или в составе ансамблей в липидном матриксе биологических мембран (например, аденилатциклаза, см. гл. XII, ансамбли оксидоредуктаз, см. гл. X, и многие другие ферменты).

Для иммобилизации ферментов используют захват их полиакриламидным гелем и иными полимерами при полимеризации составляющих их мономеров, а также захват гелями, возникающими при желатинизации природных по­лимеров, например полисахаридов морских водорослей; присоединение фер­ментов к целлюлозе, сефарозе, сефадексу, крахмалу, декстрану, агарозе и другим полисахаридам, активированным цианбромидом и другими аген­тами; привязку ферментов к стеклянным бусинкам через диазосоединение; ковалентное связывание фермента с азидными и гидразидными группами сополимера акриламида и акрилгидразина (энзакрила) и других носителей; соединение фермента с гидратированными оксидами металлов, производными поливинилового спирта, альдегидными и диазогруппами модифицированных фенольных полимеров, силикагелями и многими другими материалами.

Рис. 58. Способы перевода фермента в иммобилизованное состояние:

А — присоединение к носителю; Б — Образование перекрестных связей между ферментом и носителем; В — включение в решетчатую структуру полимерного носителя; Г — микрокапсулирование

Представляет интерес иммобилизация ферментов на мембранах аппаратов для ультрафильтрации. Соответствующие способы перевода ферментов в им­мобилизованное состояние показаны на рис. S8.

Почти из 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизовано и используется для целей инженерной этимологии примерно десятая часть (преимущественно оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы). Оптималь­ным методом иммобилизации считают включение ферментов в полимерные гели, массовым способом является адсорбционное и ковалентное присоедине­ние ферментов к носителям, более или менее распространено включение в мембраны и микрокапсулирование, единичными остаются другие приемы.

Для осуществления химических процессов с помощью иммобилизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пластинчатые, двухфазные и танкерные реакторы разного объема и производительности. Вероятно, первым реактором, где иммобилизованный фермент использовали в промышлен­ном масштабе, был реактор для разделения рацемических смесей D- и L-амино­кислот.

Он был введен в эксплуатацию в Японии (1969) на аминоацилазе, им­мобилизованной на ДЕАЕ-сефадексе:

Одновременно или даже немного раньше началось промышленное получе­ние инвертного сахара (смесь глюкозы и фруктозы, возникающая в результате гидролиза сахарозы) с помощью иммобилизованной ß-фруктофуранозидазы (сахараза или инвертаза), получившее сейчас широкое распространение. Им­мобилизованная инвертаза очень устойчива и за десять лет непрерывной работы одного из реакторов ее активность упала всего на 10%.

Не меньшее промышленное значение имеет и другой процесс, приводящий к получению эквимолярной смеси глюкозы и фруктозы: превращение глюкозы в фруктозу с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы.

Соответствующие установки работают в США (начиная с 1972 г.), ФРГ, Дании и Голландии. В нашей стране изомеризацию глюкозы в фруктозу ведут

в трубчатом реакторе с глюкозоизомеразой из Actinomyces olivocinereus, им­мобилизованной на силохроме; за месяц непрерывной работы реактора при 50%-ном уровне превращения глюкозы в фруктозу теряется не более 14% активности фермента.

В 1974 г. в Японии начат промышленный синтез L-аспарагиновой кислоты при посредстве аспартат-аммиак-лиазы, иммобилизованной на фенолформаль­дегидной смоле. Однако при высокой степени (99%) превращения фумарата аммония в L-аспарагиновую кислоту фермент менее устойчив, чем в. составе иммобилизованных клеток—время его полужизни равно 18 суткам. В этой же стране функционируют промышленные установки по синтезу L-триптофана из индола и серина при помощи включенной в волокна триптофансинтазы, а также по синтезу L-тирозина при посредстве иммобилизованной тирозинфенол-лиазы.

Упомянем еще одно крупномасштабное производство на базе иммобили­зованной пенициллинамидазы, имеющее огромное значение для фармацевти­ческой промышленности, так как оно обеспечивает исходным продуктом синтез аналогов природного пенициллина, отличающихся большей терапевти­ческой ценностью. Это — синтез 6-аминопенициллановой кислоты:

Присоединяя по ее аминогруппе иные, чем бензил, радикалы, получают пенициллины, отличающиеся специфическими качествами.

Сказанным далеко не исчерпывается список химических производств, бази­рующихся на применении достижений инженерной энзимологии, имеющей огромное будущее.

Наряду с использованием иммобилизованных ферментов продолжает раз­виваться переработка химического сырья при посредстве микроорганизмов, которые в этом случае являются как бы живыми ферментсодержащими лабо­раториями. Наиболее древним химическим производством такого рода явля­ется получение спирта путем брожения, когда примерно полтора десятка ферментов, содержащихся в дрожжевых клетках, с огромной скоростью пре­вращают глюкозу в этиловый спирт. Характерно, что в настоящее время осуществляется интенсивный переход от классических схем бродильной про­мышленности на новую технологию с использованием иммобилизованных клеток различных микроорганизмов. Так, этанол получают из глюкозы с по­мощью иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток Saccharomyces cerevisiae.

Первый в мире промышленный 1000-литровый реактор проточного типа по синтезу L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония был запущен в Японии (1973); в нем использованы иммобилизованные в полиакриламид­ном геле клетки кишечной палочки (Esherichia coli, штамм АТСС № 11303), содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

Он давал 1915 кг L-аспарагиновой кислоты/сут при 95%-ном уровне пре­вращения в нее введенного фумарата аммония. При подкислении элюата до pH 2,8 и охлаждении до 15° С аспарагиновая кислота выкристаллизовывалась в виде препарата 100%-ной чистоты. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраняют активность аспартат-аммиак-лиазы на 80% в течение 120 дней и на 50% — в течение 600 дней работы реактора, тогда как интактные клетки — всего в течение 10 дней и на уровне 25% от исходной. Отсюда ясен выигрыш, приносимый иммобилизацией. Годом позже на химическом факуль­тете МГУ им. М. В. Ломоносова была опробована установка с иммобилизо­ванными клетками кишечной палочки (штамм 85), обладающими аспартат-аммиак-лиазной активностью с производительностью несколько килограммов L-аспарагиновой кислоты особой чистоты. Такая установка в научно-исследо­вательском институте аминокислот (г. Ереван) масштабируется до промыш­ленного уровня.

Другая аминокислота, производство которой налажено в индустриальном масштабе, — L-изолейцин. Ее синтезируют из треонина и глюкозы при посред­стве иммобилизованных клеток Serratia marcescens с выходом до 4 г/л элюата с колонки реактора. Аналогичным образом получают еще одну незаменимую аминокислоту — L-лизин:

При посредстве иммобилизованных клеток Corynobacterium glutamicum производят L-глутаминовую кислоту из глюкозы; Esherichia coli — L-трипто­фан из индола; Streptococcus faecalis — L-орнитин из L-аргинина. Разработаны также методы синтеза L-аланина, L-фенилаланина, L-метионина и L-треонина тоже с помощью иммобилизованных микроорганизмов. Таким образом, нара­ботка аминокислот L-ряда для питания человека и выращивания сельскохо­зяйственных животных осуществляется в настоящее время в основном в реак­торах с иммобилизованными клетками.

С помощью иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Brevibacterium ammoniagens начиная с 1974 г. в Японии в промышленном масштабе производят яблочную кислоту из фумаровой. У нас в стране от­работан регламент получения пропионовой, уксусной и пировиноградной кислот из глюкозы, лактозы или лактата натрия в проточной системе с клет­ками пропионовокислых бактерий (Propionibacterium shermanii), иммобилизо­ванными в полиакриламидный гель.

. Опробованы на лабораторных установках, а частично и в крупномасштаб­ных вариантах методы синтеза с помощью иммобилизованных клеток различ­ных микроорганизмов АТФ, НАДФ, глюкозо-6-фосфата, глутатиона, глюко­новой и 2-кетоглюконовой кислоты, фруктозы (изомеризацией глюкозы), сме­си глюкозы и фруктозы (гидролизом сахарозы), коэнзима А и ацетил-КоА. Недавно японским химикам удалось этим же путем перевести пропилен в оксид пропилена прямым окислением кислородом — это крупное достижение внедрено в практику.

Особо следует упомянуть использование иммобилизованных клеток в фар­мацевтической промышленности для синтеза стероидных гормонов и их про­изводных, синтеза пенициллинов пролонгированного действия и ряда других лекарственных препаратов. В последнее время развернулись перспективные работы по иммобилизации методами инженерной энзимологии клеток, кото­рым при помощи приемов генетической инженерии придана способность продуцировать важнейшие лекарственные средства — инсулин, интерферон, а₁-антитрипсин. К 2000 г. намечено резко увеличить производство лекарствен­ных средств методами генетической инженерии.

Еще одна область применения ферментов — аналитическая химия. Она базируется на изготовлении электродов, покрытых иммобилизованными фер­ментами. Так, если на платиновый электрод нанести иммобилизованную глюкозооксидазу, то концентрацию глюкозы можно определить, регистрируя амперометрически количество выделяющегося на электроде пероксида во­дорода:

Определение высокоспецифично (на электроде реакция идет только с глю­козой) и осуществляется в течение 1 мин. На базе такого ферментного элек­трода создан автоматический анализатор глюкозы. При помощи ферментных электродов определяют сахарозу, мочевину, этиловый спирт, анализируют загрязнение среды остаточными пестицидами и т. п.

Не исключено, что использование ферментов позволит найти новые источ­ники для добывания энергии. Опыты в этом направлении уже сделаны и наме­тились два пути решения этой насущной для человека проблемы.

Первый состоит в прямом преобразовании химической энергии в электри­ческую в топливных элементах, где используются такие ферменты, как глюко­зооксидаза, уреаза, гидрогеназа, формиат- и алкогольдегидрогеназа (субстра­ты — глюкоза, мочевина, водород, муравьиная кислота и этанол соответствен­но). В случае алкогольдегидрогеназы в качестве фермента и этанола в качестве субстрата схема получения электрического тока такова:

Второй путь сводится к использованию в качестве источника энергии продуктов ферментативной реакции, например водорода, выделяющегося при улавливании энергии солнца (рис. 59). Расчеты показывают, что квадрат раз­мером 200x200 [км], где размещены акцепторы солнечной энергии — им­мобилизованные хлоропласты, при КПД, равном 25%, обеспечит РФ энер­гией и исключит загрязнение внешней среды.

Во многих лабораториях мира ученые настойчиво разрабатывают одну из самых сложных, но вместе с тем практически наиболее важных проблем — проблему механизма ферментативного катализа. Когда она будет полностью решена, современная нам химическая промышленность уступит место совер­шенно новому химическому производству, основанному на принципе фермен­тативного катализа, — производству, где с огромными скоростями, 100%-ными выходами, избирательно, без побочных продуктов, в мягких условиях (низкая температура и давление и т.п.) будет осуществляться превращение одних веществ в другие. Более того, полная расшифровка ферментативных механиз­мов таких процессов, как фотосинтез, биоси­нтез белков, фиксация молекулярного азота и т. п., и воспроизведение их на этой основе в лаборатории и промышленности могут в корне изменить способы добывания пище­вого и непищевого сырья и оказать огромное влияние на образ жизни человечества.

Круг химических процессов, ускоряемых ферментами, необычайно широк, а число их огромно. В природе осуществляется множе­ство ферментативных превращений, еще не­доступных воспроизведению в лаборатор­ных условиях. Все это свидетельствует об огромном значении ферментов как истинных двигателей жизненных процессов. Изучая ферменты, мы невольно были вынуждены наряду с описанием их строения и свойств уделить большое внимание ускоряемым ими химическим превращениям. Этим мы сдела­ли первый шаг к изучению ряда конкретных разделов динамической биохимии, изложен­ных в последующих главах учебника.

Рис. 59. Принципиальная схема акцеп­тирования солнечной энергии для раз­ложения воды и получения газообраз­ного топлива