Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Нуклеиновые кислоты и их обмен
Обмен нуклеиновых кислот

Изучение обмена нуклеиновых кислот представляется принципиально важ­ным в системе подготовки учителей на химико-биологических и биолого­химических факультетах пединститутов, так как круг вопросов, которые при этом рассматриваются, далеко выходит за рамки биохимии нуклеиновых кислот и позволяет дать современную трактовку проблемам наследствен­ности, изменчивости, естественного и искусственного мутагенеза, систематики и эволюции.

Изучение обмена нуклеиновых кислот имеет огромное значение и в другом аспекте. Oно исключительно важно для глубокого понимания процессов жиз­недеятельности организмов. Исследование молекулярных механизмов биосин­теза пуриновых и пиримидиновых оснований позволило открыть ряд важней­ших закономерностей в регуляции новообразования этих соединений и сфор­мулировать некоторые общие принципы регуляции обмена веществ. Раскрытие механизма специфического биосинтеза огромных молекул полинук­леотидов, при осуществлении которого с изумительной точностью обеспечи­вается порядок чередования мононуклеотидных звеньев, их составляющих, привело к признанию ведущей роли в этом процессе взаимодействия ком­плементарных пуриновых и пиримидиновых оснований. Это, в свою очередь,

дало возможность впервые понять интимный механизм обеспечения специфи­ческого воспроизведения первичной структуры макромолекул при их биосин­тезе. Данные о регуляции новообразования нуклеиновых кислот привели к фундаментальным открытиям, позволяющим сделать первые шаги к объяс­нению закономерностей не только воспроизведения специфических макромо­лекул, но также и морфогенеза.

Пути распада нуклеиновых кислот. Распад нуклеиновых кислот в организме идет достаточно энергично. Так, период полужизни молекул ДНК в тканях мыши составляет от 1 до 5 суток; период полужизни большинства мРНК у эукариот — несколько суток, а у прокариот — всего несколько секунд.    

Нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК) распадаются в организме при по­средстве особых ферментов — нуклеаз. Они ускоряют реакцию разрыва меж­нуклеотидных фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот и принадлежат, следовательно, к более широкой категории ферментов — фосфодиэстераз.

Нуклеазы, действующие на внутренние межнуклеотидные связи в молеку­лах ДНК и РНК, называются эндонуклеазами. При их участии осуществляется деполимеризация нуклеиновых кислот в основном до олигонуклеотидов. Нук­леазы, ускоряющие реакции последовательного отщепления нуклеотидов от РНК, ДНК или их фрагментов, начиная с конца полинуклеотидной цепи, называют экзонуклеазами. Они обеспечивают распад нуклеиновых кислот до свободных нуклеотидов.

В зависимости от специфичности действия среди нуклеаз различают рибо­нуклеази и дезоксирибонуклеазы. Первые ускоряют реакции распада как внут­ренних, так и внешних (концевых) межнуклеотидных связей в молекулах РНК. Вторые выполняют такую же функцию по отношению к ДНК. Вместе с тем существует большая группа неспецифических эндо- и экзонуклеаз, действую­щих одновременно и на РНК, и на ДНК.

По характеру действия на фосфодиэфирные связи в молекулах нукле­иновых кислот нуклеазы делят на две категории. Одни из них ускоряют реакцию гидролиза сложноэфирной связи межнуклеозидного фосфата с 3'-углеродным атомом остатка рибозы или дезоксирибозы, а другие — с 5'- углеродным атомом. Поэтому в названиях указанных ферментов всегда под­черкивается, гидролиз какой из связей ускоряет данная нуклеаза. Однако ведущим признаком является локализация фосфата в составе олиго- или мононуклеотидов, возникающих в результате гидролиза нуклеиновой кисло­ты. Поэтому нуклеазы, расщепляющие связь Р—5'С, называются 3'-нуклеазами, а расщепляющие связь Р—3'С именуют 5'-нуклеазами:

Важнейшими группами нуклеаз являются следующие.

Дезоксирибонуклеазы I (дезоксирибонуклеинат-5'-олигонуклеотидгидролазы) ускоряют гидролиз фосфодиэфирных связей в ДНК между остатком фосфата и 3'-углеродным атомом остатка дезоксирибози: ДНК+(n — 1) Н₂O→n олигодезоксирибонуклеотидов.

Представителями ДНКаз I являются панкреатические ДНКазы (М~31000). Первичная структура панкреатической ДНКазы быка расшиф­рована: она представлена одной полипептидной цепью из 257 аминокислотных остатков. Оптимум pH лежит между 6,8 и 8,0. Фермент активируется ионами Мn²⁺ и Mg²⁺ и ингибируется анионами, связывающими указанные катионы, а также олигонуклеотидами. Механизм действия панкреатических ДНКаз на ДНК таков, что вначале осуществляются в основном разрывы фосфодиэфир­ных связей в одной из цепей ДНК. Парные разрывы очень редки, поэтому деполимеризация идет не сразу. Конечный продукт переваривания ДНК пан­креатической ДНКазой содержит следы дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов, немного динуклеотидов и большое количество олигодезоксирибонуклеотид-5'- фосфатов, составленных в среднем из 4 мономерных звеньев. Панкреатическая ДНКаза быка существует в виде четырех множественных форм.

Дезоксирибонуклеазы II (дезоксирибонуклеинат-3'-олигонуклеотидгидролазы) в качестве конечного продукта действия образуют олигодезоксирибонуклеотид-3'-фосфаты со средней длиной молекул в 6 звеньев и небольшие количества дезоксирибонуклеозид-3'-фосфатов. Молекулярная масса ДНКазы II селезенки 38 000, оптимум pH 4,5—5,5. Ее молекула состоит из 343 амино­кислотных остатков и содержит углеводную компоненту, структурной едини­цей которой является глюкозамин. Фермент активируется ионами Mg²⁺, ингибируется ионами SO^2-₄, РО^3-₄, AsO^3-₄, АУ-кополимером, тРНК. Деполи­меризация ДНК осуществляется путем парных разрывов фосфодиэфирных связей в молекуле ДНК, в результате чего быстро накапливаются ее большие фрагменты; особенно хорошо атакуются связи, составленные из парных соче­таний ГГ и АЦ. Предполагают, что ДНКазы II являются димерами.

Кроме ДНКазы I и II существует большая группа эндонуклеаз, атакующих как дву-, так и одноцепочечную ДНК. Так, например, у кишечной палочки их 7, среди них—4 низкомолекулярные (12—33 тыс. Да) и 3 высокомолекуляр­ные (68—114 тыс. Да).    

Экзодезоксирибонуклеазы ускоряют реакцию гидролиза молекул ДНК с образованием дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатов. Из кишечной палочки вы­делено и очищено в разной степени 8 экзодезоксирибонуклеаз (I—VIII), от­личающихся друг от друга по определенным показателям. В частности, эк­зодезоксирибонуклеаза III (М = 30000) обладает способностью отщеплять 3'-фосфат, если он есть, от концевого нуклеотида фрагментов молекулы ДНК.

Рестриктазы — ДНКазы бактериального происхождения, расщепляющие чужеродные (фаговую) ДНК в строго определенных зонах, которые «узнают­ся» ферментом. Эти зоны имеют палиндромную структуру. Ниже приведены два примера, где стрелками указаны точки гидролиза фосфодиэфирных связей:

В зависимости от взаимного расположения места узнавания и точки рас­щепления ДНК рестриктазами, их относят к I типу (сайт узнавания далеко, на расстоянии сотен н. о. от точки расщепления), II типу (расщепление внутри сайта узнавания) или III типу (расщепление вблизи сайта узнавания). К 1993 го­ду выделено и охарактеризовано 2393 рестриктазы I типа, 188 рестриктаз II типа и только 4 рестриктазы III типа. Всего следовательно изучено 2585 ре­стриктаз.

Так как рестриктазы расщепляют ДНК на ограниченное число фрагментов, они нашли применение для определения первичной структуры ДНК. Однако еще более важная область их практического использования — генетическая инженерия, так как именно благодаря действию рестриктаз из ДНК выщепляются фрагменты, которые далее встраиваются в бактериальную ДНК, стано­вятся интегральной частью бактериального генома и приносят бактерии но­вые, не свойственные ей ранее биохимические признаки, такие, например, как способность синтезировать интерферон, инсулин и другие белки, находящие широкое применение в медицине (рис. 81). В принципе, такие процессы воз­можны и в геноме высших организмов. Легкое встраивание рестрикционных фрагментов ДНК в реципиентную ДНК (т. е. ДНК, включающую эти фрагме­нты в свой состав) объясняется тем, что при действии рестриктаз в точке разрыва молекулы ДНК получаются «липкие», комплементарные концы. Ввиду огромной теоретической ценности и большого практического значения этих работ в нашей стране начиная с 1975 г. осуществляются комплексные ис­следования по проекту «Рестриктаза», который планируют на последующих этапах работы превратить в более широкий проект «Нуклеаза» и привлечь к его разработке различные научно-исследовательские институты. В 1980 г. большая группа советских ученых была удостоена Государственной премии за разработку регламентов получения 30 рестриктаз и внедрение их в практику работ по генетической инженерии.

Рибонуклеази I (рибонуклеинат-3'-пиримидино-олигонуклеотидгидролазы) — эндонуклеазы, ускоряющие реакцию гидролиза РНК по пиримидино­вым нуклеотидным остаткам. Ранее их относили к рибонуклеат-нуклеотидо-2'-трансферазам циклизующим, но, поскольку 2', 3'-циклофосфаты в процессе их действия образуются как промежуточные продукты, гидролиз которых до 3'-фосфатов ускоряется тем же ферментом, в настоящее время рибонуклеазы (РНКазы) I включены в класс гидролаз.

Представителями РНКаз I являются панкреатические РНКазы, выделенные из многих объектов. Установлена первичная структура панкреатической РНКа­зы быка, свиньи, овцы, жирафа, марала, косули, северного оленя, лани, шиншиллы, мыши, крысы, морской свинки, одногорбого верблюда и нутрии. Во всех случаях, за исключением двух последних, фермент состоит из 124 аминокис­лотных остатков. Выяснена третичная структура некоторых панкреатических РНКаз. Панкреатические РНКазы могут быть однокомпонентными (рибонукле­аза А) и дьухкомпонентными (рибонуклеаза В, содержащая углеводный остаток с М = 1350). Механизм действия их на РНК детально исследован и является ярким дополнением к материалам гл. III, касающимся механизма действия ферментов.

Полипептидная цепь РНКазы, замкнутая четырьмя дисульфидными мо­стиками (рис. 82,А), принимает вследствие этого пространственную конфи­гурацию (рис. 82,2Б), в определенной мере предопределяющую третичную структуру (рис. 82,2В) этого фермента. Понять механизм действия панкре­атической РНКазы помогли данные о структуре ее активного центра (рис. 82, Г). В нем связываются участки молекулы РНК, содержащие в своем составе пиримидиновые (цитидиловые и уридиловые) нуклеотидные остатки, причем парные сочетания ЦА, ЦГ, ЦЦ и ЦУ атакуются в пропорции 3000:500:240:27. В активном центре фермента остаток пиримидинового нукле­отида РНК размещается таким образом, что пиримидиновое основание закреп­ляется в субстратном центре за счет водородных связей с радикалами тре и сер, занимающими 45-е и 123-е положения в полипептидной цепи и за счет гидрофобного взаимодействия с радикалом фен (120-й аминокислотный оста­ток). Вследствие этого остаток фосфата, расположенный между 3'-углеродным атомом рибозы пиримидинового нуклеотида и 5'-углеродным атомом сосед­него в цепи РНК нуклеотида, фиксируется между 12-м и 119-м остатками гис каталитического центра. Фиксации межнуклеозидного фосфата в этом положе­нии способствует также радикал лиз, занимающий в молекуле РНКазы 41-е положение, но расположенный в ее активном центре на расстоянии 0,5 нм от вышеупомянутых остатков гис. Вслед за этим наступает непосредственно каталитический акт, осуществляемый в результате согласованной передачи протонов и сводящийся к разрыву межнуклеотидной фосфатной связи, об­разованию 2', 3'-циклофосфата рибозы пиримидинового нуклеотида и последующего гидролиза 2', 3'-циклофосфатной связи с восстановлением ис­ходной структуры активного центра (см. схему реакции).

Рис. 81. Принципиальная схема проведения работ по гене­тической инженерии

В качестве фрагментов чужеродных ДНК используют гены, ответственные за биосинтез биологически значимых белков; их экспрессия может быть ис­пользована для биосинтеза этих белков после интеграции плазмидной ДНК в бактериальный геном или дли клонирования генов и их последующей экспрессии ж иных, чем бактериальные, белоксинтезирующих системах

Рис. 82. Структура бычьей панкреатической рибонуклеази и ее активного центра:

А — первичная структура; черными прямоугольниками обозначены—S—S-связи, арабскими цифрами — номера аминокислотных остатков, пунктиром обведены аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра; Б — расположение в пространстве полипептидной цепи; В — трехмерная модель молекулы при разрешении в 0,5 нм; зачернена впадина, на дне которой располагается активный центр; Г — структура активного центра, в котором радикалы гис, лиз, фен, сер и тре (их порядковые номера

Рис. 82. Продолжение в полипептидной цепи указаны цифровыми индексами) сближены на расстояние в несколько десятых долей нанометра; Д — пространственная структура активного центра

Существенно, что именно остатки гис, находящиеся в 12-м и 119-м положе­ниях в полипептидной цепи и сближенные в каталитическом центре фермента, обеспечивают перенос протонов.

Эта функция имидазольных радикалов гистидина воспроизводится при рассмотрении механизма действия многих других ферментов, особенно гидролаз (см раздел о гидролизе пептидной связи — с. 263, гликозидной связи — с. 331).

Гуанилрибонуклеазы (рибонуклеинат-3'-гуапило-олигонуклеотидгидролазы) ускоряют гидролиз связей по 5'-углеродному атому рибозы остатка гуаниловой кислоты и межнуклеотидного фосфата в молекуле РНК, образуя гуанозин-3'-фосфат и олигонуклеотиды с остатком гуанозин-3'-фосфата в качестве концевого нуклеотида. Первичная структура гуанилрибонуклеазы, выделенной из плесневого гриба аспергилла (Т₁-РНКаза), расшифрована (М = 11000; 104 аминокислотных остатка).

Фермент нашел широкое применение для деструкции РНК при определе­нии их первичной структуры, и именно при посредстве T₁-РНКазы Р. Холли с сотр. (1965) впервые получили крупные фрагменты тРНК^ала (см. с. 213).

Охарактеризовано еще 10 эндорибонуклеаз, выделенных из бактерий, мик­роскопических грибов, растений и животных.

Как и в случае ДНКаз, существует большая группа (более десяти) экзорибонуклеаз, ускоряющих реакции отщепления рибонуклеотидов по концевым остаткам РНК, и олигорибонуклеотидов, возникающих при селективном гидро­лизе РНК под действием эндорибонуклеаз. Таким образом, в результате деятельности разнообразных нуклеаз нуклеиновые кислоты при распаде дают сложную смесь индивидуальных рибо- и дезоксирибонуклеозид-3' и 5'-фосфатов.

Кроме перечисленных ферментов в деструкции нуклеиновых кислот прини­мают участие еще некоторые энзимы, не являющиеся гидролизами фосфодиэфирных межнуклеотидных связей, например полинуклеотидфосфорилаза и урацил-ДНК-гликозидаза.

Полинуклеотидфосфорилаза (полинуклеотид: ортофосфат-нуклеотидил-трансфераза) в отличие от всех ранее рассмотренных ферментов, участвующих в деструкции нуклеиновых кислот, является нуклеотидилтрансферазой, т. е. переносит нуклеотидные остатки с 3'-конца РНК на неорганический фосфат с образованием нуклеозиддифосфатов (НДФ):

Фермент открыт М. Грюнберг-Монаго и С. Очоа (1955) и выделен из многих источников. Он сосредоточен главным образом в микросомальной и рибосомальной фракциях клеточного содержимого. По грубой оценке его молекулярная масса близка к 230 000. Скорость реакции фосфоролиза зависит от конформации и нуклеотидного состава РНК: двухцепочечные и метилиро­ванные участки устойчивы к действию фермента. Предполагают, что in vivo полинуклеотидфосфорилаза обеспечивает деградацию клеточных РНК, осо­бенно мРНК, до нуклеозиддифосфатов, регулирует концентрацию неорганиче­ского фосфата в клетке и поставляет необходимое количество НДФ для превращения их в дезоксиНДФ.

Фермент обладает замечательной особенностью: из нуклеозиддифосфатов и их смесей in vitro он обеспечивает синтез полирибонуклеотидов с соотноше­нием в их составе мономерных звеньев в той же пропорции, как в исходном растворе. Поэтому полинуклеотидфосфорилазу широко применяли для син­теза полирибонуклеотидов того или иного состава, что сыграло выдающуюся роль в расшифровке кода белкового синтеза.

Урацил-ДНК-гликозидаза ускоряет реакцию отщепления остатка У от по­врежденной ДНК, где произошло дезаминирование остатка Ц. На возникшем апиримидиновом участке одной из цепей ДНК фосфодиэфирная связь гидроли­зуется с элиминированием дезоксирибозы, 3'-фосфат отщепляется при участии экзодезоксирибонуклеазы III и вместо отсутствующего нуклеотидного остатка встраивается новый, в данном случае остаток цитидиловой кислоты, при посредстве ДНК-полимеразной и ДНК-лигазной реакции (см. с. 251 и рис. 84).

ДНК-гликозидазы представляют новую группу ферментов, участвующих в обмене ДНК. При их посредстве удаляются и иные модифицированные пуриновые и пиримидиновые основания, после чего в серии последующих реакций восстанавливается исходная структура ДНК, т. е. эта группа фермен­тов имеет существенное значение в репарации (восстановлении структуры) ДНК. Это происходит, в частности, при замене метилированных пуриновых и пирими­диновых оснований, так как наряду с урацил-ДНК-гликозидазой изучена 3-метиладенин-ДНК-гликозидаза. Всего открыто уже 8 ДНК-гликозидаз.

Обмен нуклеозидфосфатов. Дезоксирибонуклеозидфосфаты и рибонуклеозидфосфаты, представляющие собой конечные продукты ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, распадаются далее до еще более простых соединений. Первая ступень этого распада состоит в отщеплении остатка фосфорной кислоты:

На второй ступени распада осуществляется перенос остатка рибозы от нуклеозида на фосфорную кислоту. Эта реакция ускоряется специфическими для каждого вида нуклеозидов рибозилтрансферазами. Примером может слу­жить фосфоролиз уридина:

Уридинфосфорилаза имеет М = 165кДа, содержит 6 субъединиц по 27,5 кДа, каждая из которых составлена из 253 аминокислотных остатков, в том числе из семи остатков гистидина; два из них (8-ой и 122-ой) входят в активный центр фермента.

Следовательно, в результате распада нуклеозидфосфатов выделяются в свободном состоянии рибозо-1-фосфат и все виды пуриновых и пиримиди­новых оснований, участвующих в построении нуклеиновых кислот. Приведен­ная схема распада нуклеозидов не является единственной. Возможны и другие пути распада нуклеозидов. Один из них состоит в гидролизе нуклеозидов, например:

В свою очередь, и углевод и азотистые основания видоизменяются далее. Рибоза и рибозо-1-фосфат включаются в реакции обмена, характерные для углеводов. Эти реакции будут рассмотрены ниже. Пуриновые и пиримидино­вые основания претерпевают дальнейший распад и превращаются в те или иные простейшие азотсодержащие продукты, которые далее либо выводятся из организма, либо откладываются в нем.

Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Первая фаза распада пури­новых и пиримидиновых оснований заключается в дезаминировании тех из них, которые обладают аминогруппами. Этот процесс осуществляется при посредстве специфических аминогидролаз. В результате аденин превращается в гипоксантин:

Гуанин переходит в ксантин:

Цитозин преобразуется в урацил:

Дезаминирование идет не только на уровне свободных пуриновых и пири­мидиновых оснований, но и на уровне нуклеозидов и нуклеотидов, причем во втором случае с большей интенсивностью, так как соответствующие нуклеозид- и нуклеотид-аминогидролазы более активны, чем пурин- или пиримидин-аминогидролазы. Так, аденозин и аденозинфосфат более энергично превраща­ются в инозин и инозинфосфат, чем аденин в гипоксантин:

При дальнейшем распаде дезаминированных нуклеозидов и нуклеотидов из их состава освобождаются гипоксантин, ксантин или урацил.

Дальнейшая судьба дезаминированных пуриновых и пиримидиновых ос­нований различна. Гипоксантин и ксантин окисляются в мочевую кислоту:

Реакция окисления гипоксантина в ксантин, а последнего — в мочевую кислоту ускоряется ксантиноксидазой — оксидоредуктазой с широким спект­ром действия, представляющей собой молибденсодержащий флавопротеин.

Фермент из разных источников обладает молекулярной массой от 280 тыс. до 360 тыс. Да и при действии диссоциирующих агентов распадается на две идентичные субъединицы, каждая из которых содержит одну молекулу ФАД, один атом Мо и 4 атома негеминового железа, связанных с лабильными атомами серы в кластеры типа Fe₂S₂. Активированные гипоксантин и ксантин восстанавливают молибден, последний быстро восстанавливает F₂S₂-клacтep и, наконец, флавин восстанавливает молекулярный кислород.

У ряда животных (человекообразные обезьяны, птицы, рептилии, тутовый шелкопряд) и человека конечным продуктом распада пуриновых оснований является мочевая кислота, которая и выводится из организма. Однако у большинства животных и растений есть ферменты и ферментные системы, способные ускорять реакции дальнейшего распада мочевой кислоты. От назва­ния мочевой кислоты acidum uricum и по характеру действия, выражающемуся в расщеплении (лизисе) ее, эти ферменты получили наименование ферментов уриколиза. В одних случаях (млекопитающие, насекомые) уриколиз сводится к окислению мочевой кислоты в аллантоин; в других (костистые рыбы) — процесс более сложен: аллантоин превращается в аллантоиновую кислоту, а последняя (амфибии, большинство растений) распадается на мочевину и глиоксиловую кислоту:

В отличие от гипоксантина и ксантина дезаминированные пиримидиновые основания подвергаются восстановлению. Так, урацил переходит в дигидроурацил; донором атомов Н в этой реакции служит НАДН. В свою очередь, дигидроурацил претерпевает гидролиз и превращается в N-карбамил-β-аланин, который далее гидролизуется до ß-аланина и карбаминовой кислоты. Последняя либо используется для синтеза мочевины, либо распадается до СО₂ и NH₃. Все перечисленные реакции ускоряются соответствующими ферментами:

Карбаминовая кислота и ß-аланин являются конечными продуктами распада двух пиримидиновых оснований — У и Ц. В случае Т, распадающе­гося по такой же схеме, вместо ß-аланина образуется ß-аминоизомасляная кислота.

Итак, огромные, сложные молекулы полидезоксирибонуклеотидов и полирибонуклеотидов в процессе распада в организмах животных и растений превращаются в очень простые соединения — главным образом фосфорную кислоту, СО₂ и NH₃. У организмов, расположенных на нижних ступенях эволюционной лестницы, представлен всегда полный набор ферментов, обеспечивающих распад нуклеиновых кислот именно до этих простейших продуктов. При переходе к более высокоорганизованным формам ряд ферментов, участвующих в превращении пуриновых и пиримидиновых ос­нований, выпадает и конечными продуктами обмена нуклеиновых кислот у некоторых групп организмов являются более сложные соединения, чем NH₃ и СО₂; это мочевина, аллантоиновая кислота, аллантоин и мочевая кислота.

Механизм биосинтеза нуклеозидфосфатов. Для обеспечения биосинтеза нук­леиновых кислот организм должен располагать полным набором дезоксирибо- и рибонуклеозидтрифосфатов. Поэтому в любой клетке любого организма независимо от положения его на эволюционной лестнице беспрепятственно осуществляется процесс новообразования всех видов нуклеозидтрифосфатов, нуклеозиддифосфатов и нуклеозидмонофосфатов.

Из трех основных частей нуклеотида — азотистого основания, пентозы и фосфорной кислоты — последняя в норме всегда присутствует в клетках, а вторая неминуемо возникает в процессе распада углеводов. Таким образом, только первая составная часть нуклеотида — пуриновое или пиримидиновое основание, должна создаваться специфическим путем.

Пути возникновения пуриновых и пиримидиновых оснований различны. Но есть некоторые черты сходства в механизмах их синтеза. К их числу относятся: 1) широкое использование гли, асн и глн в качестве источников азота гетероциклических колец; 2) включение в состав пуриновых и пирими­диновых циклов атомов углерода из СО₂ и формиата; 3) построение пурино­вого основания и завершение синтеза пиримидинового основания на рибозо-5-фосфате, в результате чего конечными продуктами биосинтеза являются сразу нуклеозид-5'-фосфаты, а не свободные А, Г, У, Ц и Т; 4) ферментатив­ный характер всех реакций, осуществляющихся в процессе новообразования нуклеотидов; 5) возникновение на определенном этапе биосинтеза предшест­венников, из которых потом формируются уже индивидуальные нуклеозид-5'-фосфаты.

Рассмотрим сначала механизм биосинтеза пиримидиновых оснований. Под­готовительной реакцией, открывающей этот синтез, является реакция об­разования карбамилфосфата из NH₃ и СО₂ при участии АТФ:

Далее при участии специфического фермента остаток карбаминовой кислоты (карбамил) переносится на аминогруппу аспарагиновой кислоты с образованием карбамиласпарагиновой кислоты. Эту реакцию рассматри­вают как первую специфическую реакцию в синтезе пиримидиновых нукле­отидов:

При сближении NH₂- и СООН-групп в молекуле карбамиласпараги­новой кислоты между ними осуществляется взаимодействие с выделе­нием молекул воды. Эта реакция катализируется ферментом из класса гидролаз — дигидрооротазой, названной так от дигидрооротовой кисло­ты, гидролиз которой она ускоряет вследствие обратимости данной ре­акции:

Дигидрооротовая кислота ферментативно окисляется. Снятие двух атомов Н осуществляется первичной дегидрогеназой либо с НАД⁺ или НАДФ⁺, либо с ФАД в качестве кофермента:

В молекуле оротовой кислоты, как видно из ее формулы, уже предобразована структура одного из пиримидиновых оснований, а именно урацила. Достаточно осуществить реакцию декарбоксилирования, и оротовая кислота превратится в урацил. Однако этот процесс происходит лишь после того, как оротовая кислота соединится с рибозой, образуя нуклеозид, где агликоном является остаток оротовой кислоты. Нуклеозид такого строения называется оротидином (по аналогии с цитидином и уридином). Так как реакция идет непосредственно между оротовой кислотой и 5-фосфорибозилпирофосфатом, то в ее результате возникает оротидин-5'-фосфат. Процесс ускоряется соот­ветствующей трансгликозидазой. Уравнения реакций, приводящих к синтезу оротидин-5'-фосфата, таковы:

Последнее преобразование состоит в декарбоксилировании оротидин-S'-фосфата:

В результате возникает один из пиримидиновых нуклеотидов — уридин-5'-фосфат. Уридин-5'-фосфат занимает центральное место в биосин­тезе пиримидиновых нуклеотидов, так как далее может превращаться в другие пиримидиновые нуклеотиды в соответствии со следующей схе­мой:

Схема 2. Пути превращений пиримидиновых нуклеотидов

Эти превращения пиримидиновых нуклеотидов осуществляются путем ре­акций восстановления, аминирования и метилирования моно-, ди- и трифосфорных эфиров нуклеозидов. Последние образуются при взаимодействии нуклеозидмонофосфатов с АТФ, запасы которой в клетках непрерывно попол­няются за счет реакции окислительного фосфорилирования. Например:

Восстановление протекает по гидроксильной группе при 2-м углеродном атоме рибозы, благодаря чему остаток рибозы переходит в остаток дезок- сирибозы. Эта реакция свойственна нуклеозиддифосфатам:

Донором атомов Н для восстановления рибозы при превращении рибонуклеозиддифосфата в дезоксирибонуклеозиддифосфат служит специальный бе­лок — тиоредоксин. Будучи составлен из 108 аминокислотных остатков, тиоредоксин содержит в 32-м и 35-м положениях остатки цис и располагает, следовательно, двумя HS-группами. Именно они и поставляют атомы Н, образуя дисульфидный мостик. Окисленный тиоредоксин немедленно перево­дится в восстановленную форму, получая атомы Н от НАДН при посредстве фермента тиоредоксинредуктазы.

Кроме обеспечения атомами Н реакции восстановления остатка рибозы, тиоредоксин в восстановленном состоянии способен соединяться с дву­мя другими каталитически активными белками и Б₂. Последние при этом активируются и непосредственно ускоряют процесс восстановления остатка рибозы. Они же подвержены сильному влиянию других алло­стерических регуляторов активности, в частности АТФ, ГТФ, ТТФ, дАТФ, дГТФ и др.

Таким образом, превращение рибонуклеозиддифосфатов в дезоксирибонуклеозиддифосфаты идет в соответствии со следующей схемой:

Что касается реакций аминирования (переход от УТФ к ЦТФ) и метилиро­вания (переход от дУМФ к дТМФ), то в первом случае источником амино­группы у бактерий служит NH₃, а у млекопитающих — глн, причем введение аминогруппы осуществляется сопряженно с распадом АТФ; во втором случае источником метильной группы является N⁵-метилтетрагидрофолиевая кисло­та, а реакция переноса ее ускоряется тимидилат-синтазой (димер; каждая полипептидная цепь — 316 аминокислотных остатков; первичная и третичная структуры расшифрованы).

В результате всех этих реакций обеспечивается создание в организме фонда свободных пиримидиновых нуклеозидтрифосфатов (УТФ, ЦТФ, дЦТФ, дТТФ), необходимых для синтеза ДНК и РНК.

Важной особенностью биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов является саморегуляция этого процесса. Установлено, что такие конечные продукты биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов, как ЦТФ и дЦТФ, ингибируют деятельность аспартат-карбамилтрансферазы — фермента, ускоряющего пер­вую реакцию в цепи тех взаимодействий, которые приводят к формированию пиримидинового цикла. Выявлено, что понижение активности фермента вызы­вается присоединением ЦТФ по аллостерическому центру фермента Таким образом, накопление в клетке избыточного количества ЦТФ и дЦТФ немед­ленно сказывается на активности аспартат-карбамилтрансферазы и биосинтез пиримидиновых нуклеотидов замедляется. Антагонистом ЦТФ в ингибирова­нии деятельности этого фермента является АТФ, активирующая фермент. Следовательно, торможение или стимулирование биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов зависит от соотношения в клетках организма АТФ и ЦТФ, т. е. от энергетического баланса клетки, от уровня в ней обмена веществ, в частности от уровня реакций окислительного фосфорилирования, при посредстве кото­рых высвобождающаяся в процессе окисления органических веществ энергия запасается в макроэргических связях АТФ.

Двусторонний контроль деятельности первого в цепи реакций биосинтеза фермента представляет очень четкий механизм регуляции обмена веществ и используется во многих системах биосинтеза в организме. Именно на примере биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов он исследован наиболее детально.

В заключение отметим, что одно из производных пиримидиновых нукле­отидов, а именно 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидин, подавляет развитие ретро­вирусов, в том числе вызывающих синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД):

Предложены и другие производные нуклеотидов для борьбы с этим гроз­ным заболеванием.

Перейдем теперь к рассмотрению механизма биосинтеза пуриновых основа­ний. Формирование пуринового кольца сразу идет на рибозо-5-фосфате. Поэ­тому первой реакцией является взаимодействие глутамина с 5-фосфорибозил-1-пирофосфатом при каталитическом воздействии гликозилтрансферазы, уско­ряющей перенос остатка 5-фосфорибозы на амидогруппу глутамина. Видимо, одновременно протекает гидролиз возникающего 5-фосфорибозилглутамина, вследствие чего выделяется 5-фосфорибозиламин:

В присутствии АТФ при участии специфической лигазы (аминосинтетаза) к 5-фосфорибозиламину присоединяется глицин, причем возникает пептидная связь:

Молекула 5-фосфорибозилглицинамида удлиняется на один углеродный атом при посредстве фосфорибозилглицинамид-формилтрансферазы. Ее ко­ферментом служит тетрагидрофолиевая кислота, присоединяющая форми­льную группировку по атому азота, занимающему 5-е положение в молекуле кофермента.

С N-формилтетрагидрофолиевой кислоты осуществляется перенос форми­льного остатка на H₂N-гpyппy 5-фосфорибозилглицинамида. Получившийся в результате этой реакции 5-фосфорнбозилформилглицинамцд взаимодействует с глутамином в присутствии сопряженно распадающейся АТФ и соответству­ющей лигазы (см. два первых уравнения на схеме 3 (с. 242)).

Продуктом реакции является производное, где карбонильный кисло­род пептидной связи замещен на иминогруппу. Затем в результате ряда преобразований возникшего при этом соединения замыкается имидазоль­ный цикл. Данный процесс также идет сопряженно с распадом АТФ и ускоряется специфическим ферментом, который, будучи выделен и очи­щен, характеризуется относительно невысокой устойчивостью к денату­рации.

Весьма существенно, что реакция, в результате которой образуется имида­зольная часть будущего пуринового остатка, практически необратима в от­личие от подавляющего большинства остальных стадий рассматриваемого процесса.

Вслед за этим на имидазольном цикле путем ряда ферментативных реак­ций отмеченного выше типа из аспарагиновой кислоты, СО₂ и формиата строится пиримидиновое кольцо, т. е. в конце концов создается пуриновый нуклеотид. Схема, включающая главные этапы этого синтеза, такова:

Схема 3. Механизм биосинтеза пуриновых нуклеотидов

Если подытожить, из каких соединений строится пуриновый цикл, то окажется, что он возникает из очень простых веществ:

Из приведенной схемы ясно, что 1-й атом азота пуринового цикла ведет свое происхождение от аспарагиновой кислоты, 3-й и 9-й — от глутамина, а 7-й — от глицина. Что касается происхождения атомов углерода пуринового кольца, то видно, что источниками их явились формиат (2-й и 8-й атомы углерода), глицин (4-й и 5-й) и СО₂ (6-й атом). Химические уравнения, приведенные на схеме 3, показывают детали включения тех или иных атомов N и С из состава перечисленных соединений в пуриновую часть нуклеотида в процессе его биосинтеза.

Пиримидиновое кольцо пиримидиновых нуклеотидов синтезируется в ор­ганизме из аналогичных соединений: NH₃, СО₂ и аспарагиновой кислоты. Таким образом, исходные вещества для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых оснований в организме исключительно доступны, всегда присутствуют в нем, так как аммиак, формильная группа и оксид углерода (IV) образуются в процессе деструкции разнообразных органических соединений или поступают в ор­ганизм извне, а глутаминовая и аспарагиновая кислоты и их амиды представ­ляют первичные в большом объеме синтезируемые аминокислоты, что имеет большое значение для обеспечения беспрепятственного синтеза этих важней­ших для организма соединений.

Как следует из схемы 3, пуриновые нуклеотиды в результате последова­тельных реакций наращивания пуринового цикла на рибозо-5-фосфате воз­никают в виде инозин-5'-фосфата. Последний способен окисляться в ксантозин-5'-фосфат. В результате аминирования первого синтезируется аденозин-5'-фосфат, а второго — гуанозин-5'-фосфат. И тот и другой процессы ускоря­ются специфическими ферментами (см. уравнение реакции на с. 244).

В свою очередь, пуриновые нуклеозидмонофосфаты превращаются далее в нуклеозидтрифосфаты. При этом гуанозин-5'-фосфат переходит в гуанозин-5'-трифосфат по двойной обменной реакции с АТФ:    

При взаимодействии аденозин-5'-фосфата с АТФ возникает аденозиндифос­форная кислота; эта реакция открыта А. В. Котельниковой в начале 60-х годов нашего века:

Она служит субстратом при окислительном фосфорилировании, в результате которого запасы АТФ в организме непрерывно пополняются, что обеспечивает достаточное ее количество для превращения всех остальных нуклеозидмонофосфатов в нуклеозидтрифосфаты.

Синтез дезоксиаденозин-5'-трифосфата (дАТФ) и дезоксигуанозин-5'-трифосфата (дГТФ) осуществляется посредством реакции восстановления рибозы по гидроксильной группе при втором углеродном атоме. В случае дГТФ реакция восстановления идет на уровне ГДФ с последующим превращением дГДФ в дГТФ:

Механизм реакции восстановления остатка рибозы в остаток дезоксирибозы в случае пуриновых рибонуклеозиддифосфатов идентичен рассмотренному ранее для пиримидиновых нуклеотидов. Сам же процесс восстановления сти­мулируется дГТФ и дТТФ, но ингибируется дАТФ.

Как и в случае пиримидиновых нуклеотидов, конечные продукты биосин­теза пуриновых нуклеотидов (ИМФ, АМФ, АДФ, АТФ, ГМФ, ГДФ и ГТФ) угнетают действие амидофосфорибозилтрансферазы — фермента, ускоряющего 1-ю реакцию в цепи процессов, приводящих к новообразованию пуринового кольца. Таким образом, осуществляется саморегуляция образования пурино­вых нуклеотидов. Кроме того, при помощи специфического перекрестного участия АТФ и ГТФ в реакциях, ведущих к превращению ИМФ в ГМФ и АМФ соответственно, последние синтезируются в организме всегда в строго опреде­ленном соотношении:

Схема эта весьма показательна: она дает представление о принципах саморегуляции, используемых в организме, когда обеспечивается синтез ряда веществ в определенной пропорции по отношению друг к другу. Обеспечение строго определенного соотношения нуклеозидтрифосфатов в организме имеет исключительное значение, так как из них образуются нуклеиновые кислоты. Сходные регуляторные процессы отмечены также в синтезе пиримидиновых нуклеотидов.

Существует еще один путь синтеза пуриновых и пиримидиновых нукле­отидов в организмах — из свободных пуриновых и пиримидиновых основа­ний и 5-фосфорибозил-1-пирофосфата. Он не является, конечно, способом синтеза данных нуклеотидов заново, так как при этом используются гото­вые пуриновые и пиримидиновые циклы, освободившиеся при распаде нуклеиновых кислот; он лишь сберегает пуриновые и пиримидиновые ос­нования от их распада до соответствующих конечных продуктов. Эта реакция ускоряется специфическими ферментами — фосфорибозилтрансферазами:

Этот путь, в частности, ярко представлен в злокачественных опухолях.