Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Нуклеиновые кислоты и их обмен
Биосинтез ДНК и РНК

Выше было показано, что в живой природе осуществляются реакции, обеспечивающие беспрепятственный синтез дезоксирибо- и рибонуклеозид-5'-трифосфатов всех видов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, а также АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ. Характерно, что новообразование этих соединений регулируется таким образом, что они возникают зависимо друг от друга в строго опреде­ленной пропорции. Следовательно, в организме всегда обеспечено существова­ние всех их одновременно в необходимых концентрациях. Именно из нуклеозидтрифосфатов и осуществляется биосинтез нуклеиновых кислот.

Первой характерной чертой специфического биосинтеза нуклеиновых кис­лот является то, что он протекает только при наличии всех четырех видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ) в случае синтеза ДНК или же в присутствии всех четырех видов рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ) в случае синтеза РНК. Вторая — состоит в том, что биосинтез идет при каталитическом воздействии ферментов — ДНК- или РНК-полимераз. Третья весьма своеобразная черта — необходимость для его осуществления затравки в виде уже готового полинуклеотида, который играет роль матрицы. Последнее имеет принципиальное значение, так как именно благодаря этому обеспечивается специфический биосинтез нуклеиновых кислот со строго заданной последовательностью нуклеотидных остатков в молекуле.

Общая схема биосинтеза дезоксирибонуклеиновых кислот может быть представлена в следующем виде:

Она была впервые предложена А. Корнбергом (1958) на основании опытов, проведенных с ДНК-полимеразой, выделенной из кишечной палочки. В том же году С. Шпигельман тоже из кишечной палочки получил РНК-полимеразу (см. рис. 46). Позже она была изолирована из тканей млекопитающих и других животных. РНК-полимераза in vitro обеспечивает синтез РНК по аналогичной схеме:

Химизм реакции образования нуклеиновых кислот. Механизм происходящей при биосинтезе нуклеиновых кислот химической реакции заключается в пере­носе остатка нуклеозидмонофосфата от нуклеозидтрифосфата на концевой нуклеотидный остаток растущей в процессе синтеза полинуклеотидной цепи. Перенос идет на место атома Н гидроксильной группы, стоящей при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы концевого нуклеотида, и сопровождается выделением пирофосфата; поэтому фермент, осуществляющий ускорение реакции переноса нуклеотидного остатка, называют нуклеотидил-трансферазой:

На свободную гидроксильную группу при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибози вновь присоединенного нуклеотидного остатка может поступить следующий нуклеотидный остаток, и, таким образом, будет осу­ществляться ступенчатый (градуальный) биосинтез полинуклеотида путем нара­щивания его с одного конца. Энергия для синтеза поступает за счет распада макроэргической связи в трифосфатной группировке при освобождении пиро­фосфата.

Механизм воспроизведения первичной структуры при биосинтезе нуклеи­новых кислот. Процесс ступенчатого синтеза полинуклеотидной цепочки осуществляется на матрице, вдоль которой располагаются один за другим те или иные дезоксирибо- или рибонуклеозидтрифосфаты, вступающие затем в реак­цию конденсации с выделением пирофосфата (рис. 83, А). Порядок расположения нуклеозидтрифосфатов вдоль полинуклеотидной матрицы задается чередовани­ем нуклеотидных звеньев, присущим ДНК или иногда РНК, выполняющим матричную функцию. При этом к определенному пуриновому или пиримидино­вому основанию полинуклеотида (матрица) присоединяется комплементарное пуриновое или пиримидиновое основание соответствующего нуклеозидтрифосфата. В результате вновь синтезируемая полинуклеотидная цепь в целом будет комплементарна полинуклеотидной цепи матрицы (рис. 83, А).

Рис. 83. Схема матричного биосинтеза нуклеиновых кислот (А) и удвоения молекул ДНК (А) при их репликации (пояснение в тексте)

Так как формирование нового полинуклеотида идет на полинуклеотидной матрице при непрерывном замыкании водородных связей между комплемен­тарными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями матрицы и нуклеозид­трифосфатов, то условием функционирования этого механизма является одно­цепочечная структура матрицы. Поэтому в случае биосинтеза молекул ДНК, характеризующихся биспиральной структурой, существенным моментом в биосинтезе следует признать расхождение биспирального полидезоксирибонуклеотида на одиночные полинуклеотидные цепи, на которых, собственно, и осуществляется сборка комплементарных им полинуклеотидов. В итоге из одной биспиральной молекулы ДНК образуются две биспиральные молекулы ДНК, совершенно идентичные друг другу и исходной молекуле ДНК (рис. 83, Б). Как качественный состав, так и количественное содержание нукле­отидных остатков в матричной и вновь синтезированной на ней нуклеиновой кислоте совпадают (табл. 21).

Таблица 21 Молярные соотношения оснований в составе ДНК, синтезированной в присутствии разных матриц

Это дает основание рассматривать изложенный выше механизм биосинтеза нуклеиновых кислот как гомологическую репликацию, т. е. бесконечное повто­рение процесса удвоения числа молекул путем прямого, непосредственного копирования их структуры.

Описанный выше (см. рис. 83, Б) механизм удвоения молекул ДНК был доказан в опытах, где исходную ДНК родительских клеток метили тритием или ¹⁵N. В дочерних клетках после 1-го деления метку обнаруживали во всех молекулах ДНК, но в меньшем количестве, так как она содержалась здесь лишь в одной из полидезоксирибонуклеотидных спиралей ДНК. Такой способ удвоения молекул ДНК называется полуконсервативным. После 2-го деления половина молекул ДНК во вновь образованных «внучатых» клетках оказыва­ется немеченой, так как гомологическая репликация в процессе 2-го деления идет как на меченых, так и на немеченых одноцепочечных полидезоксирибонуклеотидах, возникающих при расхождении биспиральных молекул ДНК, ме­ченных только по одной из цепей.

Ферменты биосинтеза ДНК. В биосинтезе ДНК участвуют не только ДНК-полимеразы, но и РНК-полимераза, эндонуклеаза, ДНК-лигаза и другие фер­менты.

Впервые ДНК-полимераза была выделена из кишечной палочки А. Корнбергом и сотр. (1958). Поскольку в последующие годы из этой же бактерии были выделены еще две полимеразы, она получила название полимеразы I.

В клетке кишечной палочки содержится около 400 молекул ДНК-полимеразы I — белка (М = 109 000), содержащего один атом Zn и представленного одной полипептидной цепью. ДНК-полимераза I хорошо связывается с одно­цепочечной ДНК или с зонами разрыва фосфодиэфирных связей в биспираль­ной ДНК. Она обладает ясно выраженной ДНК-полимеразной активностью, т. е. способна ускорять реакцию переноса дезоксирибонуклеотидильных оста­тков с дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов на растущий конец полидезоксирибонуклеотида — 3'-гидроксильную группу дезоксирибозы его концевого нуклеозида.

Кроме того, ей присуща экзодезоксирибонуклеазная активность в отноше­нии одноцепочечной ДНК в направлении 3'→5', т. е. тоже со стороны кон­цевого дезоксирибонуклеозида, а также в направлении 5'→3' со стороны начального дезоксирибонуклеотида молекулы. В 1-м случае достигается уда­ление с наращиваемого в процессе синтеза ДНК 3'-конца молекулы неправиль­но (ошибочно) присоединенных нуклеотидных остатков, во 2-м — разрушение праймера, необходимого для синтеза фрагментов Оказаки (см. ниже). Послед­нее очень важно. Так, у мутантов кишечной палочки, утративших эту функцию ДНК-полимеразы I, накапливаются фрагменты Оказаки и биосинтез ДНК приостанавливается. Сейчас полагают, что ДНК-полимераза I имеет большее отношение к «созреванию» реплицирующейся ДНК, нежели непосредственно к полимеразным процессам в репликационной вилке. Последняя функция более присуща ДНК-полимеразе III.    

ДНК-полимераза II присутствует в клетке кишечной палочки в количестве около 40 молекул (М = 90000). Она представлена одной полипептидной цепью. ДНК-полимераза II плохо соединяется с одноцепочечными ДНК, но отлично оккупирует точки разрыва в одной из цепей биспиральной ДНК. Обладает лишь 10%-ной ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-полимеразой I.

Считают, что основной функцией ДНК-полимеразы II является достраива­ние поврежденных участков в молекуле ДНК, т. е. репарация ДНК. Предпола­гают, что ДНК-полимераза I in vivo несет эту же функциональную нагрузку.

Главной полимеразой кишечной палочки является ДНК-полимераза III. Это — сложный, термолабильный белок (М = 300 000), состоящий из субъеди­ниц а (140000), ß (37000), у (52000), δ (32000), ε (25000) и Θ (10000); полимеразную реакцию осуществляет каталитический кор из а-, в- и Θ-субъединиц, в котором главную роль играет а-субъединица; ß-, у- и 6-субъеди­ницы являются регуляторными и усиливают действие каталитического ядра ДНК-полимеразы III. В клетке кишечной палочки всего 20 молекул этого белка. Именно ДНК-полимераза III ответственна у кишечной палочки за процесс репликации ДНК. Она работает в ее клетке в комплексе с белковыми факторами, тоже принимающими участие в репликации ДНК, полностью обеспечивая главную ступень ее биосинтеза — элонгацию (продолжение) сбор­ки дезоксиполирибонуклеотидной цепи.

Не менее сложен вопрос о ДНК-полимеразах эукариот. Их номенклатура оказалась крайне запутанной, поэтому на международной конференции по ДНК-полимеразам эукариот (США, 1975) она была унифицирована; услови­лись называть их ДНК-полимеразы-а, -ß и -у.

ДНК-полимераза-а впервые обнаружена у млекопитающих (М = 150 000—200 000). Фермент, полученный из тимуса теленка, содержит каталитическую (М = 118 000) и регуляторную (М = 54 000—64000) субъеди­ницы. Это — кислый белок (pІ 5,5), сильно ингибируемый агентами, блокиру­ющими HS-группы. Ее полимеразная активность максимальна при pH 7,2 в присутствии биспиральной ДНК, но не АТ-кополимера. Хотя она и об­наруживается в цитоплазме, ее истинная локализация — в ядре, где сосредото­чено ~ 25 000 ее молекул.

ДНК-полимераза-ß (М = 45000) характеризуется устойчивостью к действию агентов, блокирующих HS-группы, хорошо выраженной способностью уско­рять при pH 8,4 реакцию копирования и ДНК, и АТ-кополимера, является основным белком (pІ 9,2). В клетке содержится в количестве ~8000 молекул, локализованных в ядре и участвующих в репарации ДНК.

ДНК-полимераза-у — кислый белок (pІ 5,8) с М = 180000, тетрамер из иден­тичных субъединиц; ее полимеразная активность, зависит от целостности HS-гpyпп. При pH 8,5 энергично ускоряет репликацию АТ-кополимера и гора­здо менее активна с природной ДНК. В клетке присутствует в количестве ~ 1000 молекул, локализована в митохондриях, где обеспечивает репликацию митохондриальной ДНК.

Ни одна из ДНК-полимераз эукариот, в отличие от таковых прокариот, не обладает нуклеазной активностью. Их биологические функции выяснены пока недостаточно. Механизм действия ДНК-полимераз представлен на рис. 83.

Кроме ДНК-полимераз, обладающих у прокариот к тому же нуклеазной активностью, в биосинтезе ДНК принимает участие ДНК-лигаза. Она открыта в 1967 г. одновременно в пяти лабораториях. Это белок с М = 96000. В клетке кишечной палочки, например, насчитывается около 2000 молекул ДНК-лигазы. Ее функция состоит в обеспечении каталитического ускорения реакции образования фосфодиэфирной связи между 3'- и 5'-концами цепей ДНК, сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной им, но непрерывной другой цепи ДНК. Такая ситуация возникает во многих случаях: при устранении разрывов в одной из цепей ДНК, вызванных облучением, действием нуклеаз и т.п.; при соединении новооб­разованного при репарации или в процессе нормальной репликации фрагмента с предшествующими или вновь созданными при этом фрагментами ДНК; при ковалентном замыкании линейной молекулы ДНК в кольцевую структуру и т. п. Механизм ДНК-лигазной реакции представлен на рис. 84. ДНК-лигаза нашла применение в работах по синтезу генов и их фрагментов.

Белковые факторы, необходимые для биосинтеза ДНК. Наряду с перечис­ленными выше ферментами в биосинтезе ДНК принимают участие белковые факторы, каждый из которых выполняет собственную функцию.    

ДНК-связывающий белок впервые выделен В. Альбертсом и Л. Фреем (1970) из лизатов кишечной палочки, зараженной фагом Т4. Вначале он был назван белком 32—по номеру гена в хромосоме фага Т4, ответственного за биосинтез этого белка. Белок характеризуется молекулярной массой 35000 (собственный ДНК-связывающий белок кишечной палочки имеет М = 22000), высокой степенью асимметрии молекулы (b/a = 4), преобладанием дикарбоно­вых аминокислот над диаминокислотами. Белок представлен одной полипеп­тидной цепью и обладает ярко выраженной способностью связываться с одно­цепочечной ДНК или дефектными участками биспиральной ДНК, резко осла­бляя взаимодействие полидезоксирибонуклеотидных цепей в ее молекуле, что выражается в понижении температуры плавления ДНК на 30—40°.

ДНК-связывающий белок активирует ДНК-полимеразы II и III. Сейчас он выделен и из клеток эукариот. В противоположность ДНК-связывающему белку существует и выделен белок, биосинтез которого у кишечной палочки кодируется геном № 5 фаговой хромосомы. Этот белок полностью блокирует матричную активность ДНК, т. е. является антагонистом ДНК-связывающего белка.

ДНК-раскручивающий белок описан Дж. Янгом (1971) и назван белком ω. Предполагают, что он обладает нуклеазной активностью и, присоединяясь к ДНК, разрывает фосфодиэфирную связь одной из ее цепей, вследствие чего обеспечивается свободное вращение вокруг фосфодиэфирной связи другой цепи и раскручивание суперспиральной молекулы ДНК. Его антагонист — ДНК-закручивающий белок вызывает суперспирализацию ДНК, ему присущи ДНК-зависимая АТФазная активность и механохимические свойства.

При изучении биосинтеза ДНК у кишечной палочки и ее мутантов тести­ровано еще несколько белков, участвующих в репликации ДНК (рис. 85), и функции некоторых из них уже выяснены. Среди них особый интерес представляет хеликаза — фермент, расплетающий двойную спираль ДНК. При молекулярной массе около 75 000 Да его полипептидная цепь из 650 амино­кислотных остатков (первичная структура выяснена) организована в виде двух крупных доменов из 286 и 364 аминокислот (в каждом по 2 субдомена) и пространственно организована так, что может охватывать биспиральную молекулу ДНК, расплетая ее за счет энергии распадающейся АТФ.

Рис. 84. Механизм ДНК-лигазной реакции

Реакция идет в три стадии: I — ДНК-лигаза взаимодействует с АТФ (или НАД⁺) с образованием ферментадепилатного производ­ного по εNH₂-гpyппe остатка лизина полипептидной цепи фермента и выделением пирофосфата (или иикотинамидрибозофосфата); II — остаток адениловой кислоты с крайне активной в химическом отношении аденилатлигазы перебрасывается на свободную фосфатную группу 5'-углеродного атома рибозы концевого нуклеотида; ДНК-лигаза при этом высвобождается; III — между сближенными активированной аденилатом 5'-фосфатной группой и 3'-гидроксильной группой фрагментов цепи ДНК происходит спонтанное взаимодействие с образованием фосфодиэфирной связи с выделением АМФ

Этапы биосинтеза ДНК. Исходя из приведенных выше данных о ферментах и белковых факторах, принимающих участие в биосинтезе ДНК, постулирова­на схема этого процесса. Она базируется на представлении о существовании репликативного комплекса ферментов и белковых факторов, необходимых для осуществления биосинтеза ДНК, локализованных в репликативной вилке, т. е. той зоне ДНК, где происходит распаривание биспирального полидезоксирибонуклеотида и сборка дочерних, новообразуемых цепей ДНК (рис. 85): В со­ответствии с этой схемой биосинтез ДНК распадается на 3 этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Следует подчеркнуть, что многие вопросы, каса­ющиеся механизма биосинтеза ДНК, еще не до конца выяснены и рассмат­риваемая модель является в определенной мере условной.

Инициация биосинтеза ДНК, понимаемая в узком смысле как начало био­синтеза дочерних полидезоксирибонуклеотидных цепей на материнских, сво­дится к созданию на материнской цепи ДНК затравочного олигонуклеотида со свободной гидроксильной группой на 3'-конце этого олигонуклеотида. Без него не работает ни одна из ДНК-полимераз. Этот короткий (несколько десятков звеньев) олигорибонуклеотид, заканчивающийся пиримидиновым нуклеозидом, является праймером, т. е. предшественником будущей цепи ДНК, и синтезируется при участии фермента типа РНК-полимеразы, получи­вшего название праймазы (М = 60000, 100 молекул в клетке кишечной палоч­ки). Только после его создания в синтез включается ДНК-полимераза III, при посредстве которой синтезируется далее на материнской цепи ДНК дочерняя цепь ДНК. Впоследствии ковалентно присоединенный к этой новообразован­ной цепи ДНК фрагмент РНК (праймер) «вырезается» при помощи нуклеаз и одноцепочечная брешь застраивается олигодезоксинуклеотидным фрагмен­том тоже при посредстве ДНК-полимеразной (репаразной) реакции (рис. 85).

Инициация биосинтеза ДНК, понимаемая в более широком смысле как комплекс процессов, приводящих к старту в биосинтезе ДНК, сводится к воз­никновению репликативного комплекса ферментов и белковых факторов и формированию репликативной вилки (рис. 85). Она включает присоединение к биспиральной ДНК (к одноцепочечному ее фрагменту в момент распарива­ния биспиральной структуры в результате флухтуаций) ДНК-связывающего белка, ДНК-раскручивающего белка, ДНК-полимеразного комплекса, ДНК- зависимой РНК-полимеразы (праймазы), а также комплекса белковых факто­ров, называемого праймосомой и обеспечивающего продвижение репликатив­ной вилки (рис. 85), ее пространственную организацию и функционирование.

Элонгация биосинтеза ДНК складывается по меньшей мере из двух процес­сов: репликации участков материнских цепей ДНК и соединения друг с другом синтезированных при репликации фрагментов новообразуемых цепей ДНК. Первый осуществляется при посредстве ДНК-полимеразной реакции (см. рис. 83), идущей со скоростью (в н. о./с) в среднем около 1000 у бактерий, 100 — у животных и 10 — у растений. Своеобразие его состоит в том, что репликация идет не непрерывно, а фрагментарно: за один раз у прокариот синтезируется полидезоксирибонуклеотид с коэффициентом седиментации 8—10S, т.е. молекулярной массой в несколько сотен тысяч дальтон (примерно из 1000 н. о.). У эукариот фрагменты Оказаки короче, около 200 н. о., что сопо­ставимо с длиной нуклеосомной ДНК, в чем, по-видимому, есть определенный смысл. Эти фрагменты получили название фрагментов Оказаки в честь японского биохимика, впервые в 1967 г. на VII Международном биохимическом конгрессе в Токио предложившего схему биосинтеза ДНК, в которой были преодолены трудности, связанные с антипараллельностью цепей ДНК в ее биспиральной молекуле. Дело в том, что ДНК-полимеразы способны наращивать полинуклео­тидную цепь в направлении только 5'→3', т. е. путем переноса нуклеотидного остатка с дезоксирибонуклеозидтрифосфата на гидроксильную группу 3'-углеродного атома растущей полидезоксирибонуклеотидной цепи. Но так как цепи материнской ДНК антипараллельны, т. е. направление чередования нуклеотид­ных звеньев в них противоположно (см. рис. 85), то один и тот же фермент, т. е. ДНК-полимераза, не может обеспечить сборку дочерних цепей одновременно в направлениях 5'→3' и 3'→5' в соответствии с перемещением репликационной вилки при расплетании биспиральной молекулы ДНК. Т. Оказаки предположил, что ДНК-полимераза ведет синтез ДНК челночным способом: сначала передви­гаясь вперед в направлении 5'→3' по одной цепи, а затем в том же направлении 5'→3', но передвигаясь в обратную сторону по другой цепи. Те фрагменты Оказаки, у которых олигорибонуклеотидные праймеры заменены при участии ДНК-полимеразы I на дезоксирибонуклеотидные фрагменты, при посредстве ДНК-лигазы объединяются вместе (см. рис. 84 и 85) и дают начало дочерней цепи ДНК. Есть и другой взгляд на механизм преодоления антипараллельности цепей ДНК; суть его ясна из рассмотрения рис. 85, Б и легенды к нему.

Рис. 85. Схема биосинтеза фаговой ДНК в клетке кишечной палочки:

А — плоскостная модель, согласно которой синтезу затравочного олигориболуклеотида (праймера) под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы (праймазы) способствует белковый комплекс, называемый праймосомой (n — 25 кДа, n' — 75 кДа, n'' — 11 кДа, і — 80 кДа, dna — 300 кДа, dnaC — 29 кДа), движущийся в направлении, противоположном элонгации, я создающий новые центры синтеза праймера. Раскручивание биспиральной ДНК на одноцепочечные полидезоксирибонуклеотиды осуществляется хеликазой (от англ. helix — спираль), а релаксация суперспиральной ДНК — гиразой (от англ. gyration — кругловращательное движение). Б — пространственная модель, демонстрирующая преодоление антипараллельности цепей ДНК за счет возникновения петли ДНК, где чередование фосфоридиэфирных связей на ее восходящем отрезке изменяется на обратное и не препятствует ДНК-полимеразе вести синтез фрагмента Оказаки на ведомой цепи родительской ДНК в том же направлении, что и на ведущей цепи. Остальные пояснення в тексте

Вопрос, синтезируются ли на одной из цепей родительской ДНК фрагменты Оказаки, т. е. идет ли на ней прерывистый биосинтез цепи дочерней ДНК, а на другой — непрерывный биосинтез цепи дочерней ДНК, остается дискуссион­ным. Видимо, как правило, происходит прерывистый синтез на обеих цепях родительской ДНК, а сочетание прерывистого и непрерывного является ис­ключением, вполне доказанным для репликации некоторых фаговых ДНК. Решение проблемы одно- или двунаправленной репликации однозначно: от точки инициации репликационные вилки распространяются по биспиральной молекуле ДНК в двух противоположных направлениях.

По поводу терминации биосинтеза ДНК мнения разноречивы. Предполага­ют, что прекращение репликации ДНК программируется особой нуклеотид­ной последовательностью, в том числе в виде специальных палиндромов («кроличьих ушей») на конце хромосомы. Само собой разумеется, что репли­кация прекращается, когда встречаются две репликационные вилки при удвое­нии как кольцевых, так и линейных ДНК. Наконец, возможно достраивание ведомой цепи за счет праймирования 3'-конца материнской цепи с участием специфического белка, находящегося на ее конце.

Точность репликации ДНК весьма велика — одна ошибка на 10¹⁰ нуклеотидилтрансферазных реакций. Но даже если ошибка допущена, она может быть исправлена в ходе репарационных процессов.

Биосинтез ДНК на РНК в качестве матрицы. Кроме рассмотренного выше механизма биосинтеза ДНК на полидезоксирибонуклеотидной матрице в по­следние годы открыта система биосинтеза ДНК на РНК при посредстве фермента, названного обратной транскриптазой или ревертазой (его называют также РНК-зависимой ДНК-полимеразой). Этот фермент был обнаружен в 1970 г. независимо друг от друга Д. Балтимором в составе вируса Раушера лейкемии мышей и Г. Теминым и С. Мизутани в составе вируса саркомы Рауса. Ревертаза активируется Мn²⁺ сильнее, чем Mg²⁺, и содержит Zn. Синтезиро­ванная ДНК имеет небольшую молекулярную массу и характеризуется конста­нтами седиментации от 2S до 7S. Как и обычные ДНК-зависимые ДНК- полимеразы, ревертаза нуждается в праймере, роль которого может играть тРНК, в чем проявляется регулирующая роль последней в обмене веществ. Ее молекулярная масса колеблется от 70 до 180 кДа в зависимости от объекта, из которого она выделена; фермент, как правило, состоит из двух субъединиц.

Значение открытия ревертазы состоит прежде всего в том, что выявлен дополнительный механизм биосинтеза ДНК, который, как предполагают, может использоваться для амплификации генов. Исследование ревертазной реакции крайне существенно для изучения перерождения нормальной клетки в раковую. Ревертаза нашла применение в молекулярной биологии для син­теза генов и фрагментов генов и, как следствие этого, в генетической ин­женерии. Новой областью ее использования является массовая расшифровка через кДНК первичной структуры РНК и белков.

Учитывая исключительную важность работ по исследованию обратной транскрипции, в нашей стране начиная с 1972 г. осуществляют проект «Ревер­таза», в разработке которого принимали участие академии наук СССР и стран СЭВ. В результате проведенных исследований удалось создать универсальную систему обратной транскрипции, позволяющую вести синтез ДНК с любой заданной точки в молекуле РНК при помощи синтетического праймера (октадезоксирибонуклеотид заданного строения), комплементарного межгенной зоне одной из фаговых РНК. Кроме того, путем ревертазной реакции получена ДНК на глобиновой мРНК голубя и гигантских ядерных РНК. Действием ревертазы in vivo в ДНК введена онкогенная информация, успешно изучается структура РНК-содержащих опухолеродных вирусов, синтезированы потенци­альные ингибиторы ревертазы.

Продолжаются интенсивные работы по изучению свойств ревертаз, выде­ленных из различных опухолеродных вирусов (в том числе человека), синтезу ингибиторов ревертаз, не действующих на клеточные ДНК-полимеразы, полу­чению ДНК-транскриптов для работ по генетической инженерии, исследова­нию интеграции ДНК, синтезированной на вирусной РНК, в геном клетки.

За этот цикл работ группе советских исследователей и ученых стран СЭВ в 1979 г. присуждена Государственная премия СССР. Начиная с 1980 г. проект «Ревертаза» преобразован в проект «Ревертаза-онкоген».

Биосинтез РНК. Биосинтез РНК осуществляется на ДНК в качестве матри­цы. С точки зрения передачи информации в живых системах он характеризует­ся как процесс транскрипции, т.е. переписывания информации, содержащейся в последовательности нуклеотидных остатков в ДНК-матрице, в последователь­ность нуклеотидных звеньев в молекуле новообразуемой РНК. Та часть молеку­лы ДНК, которая копируется в процессе биосинтеза РНК на ней, носит название транскриптона. Последний содержит информативную и неинформа­тивную зоны. Транскрибирование информативной зоны приводит к образова­нию той части новообразуемой РНК, которая впоследствии дает начало РНК с определенной функциональной активностью. При копировании неинформа­тивной зоны продуцируется та часть насцентной РНК, которая впоследствии, в процессе созревания вновь синтезированной РНК, разрушается. Соотноше­ние информативной и неинформативной частей в транскриптонах прокариот и эукариот резко различно и составляет ъ среднем 9:1 и 1:9 соответственно.

Неинформативная зона транскриптона содержит регуляторные последова­тельности, с которыми взаимодействуют многочисленные (их открыто не­сколько десятков) регуляторные белковые факторы, ускоряющие или замедля­ющие процесс транскрипции. Они контактируют с определенными последова­тельностями нуклеотидных остатков в ДНК присущими им ДНК-связывающими доменами. Так, например, транскрипционный фактор ІІІА из ооцитов шпорцевой лягушки содержит ßß'a — надвторичную структуру с атомом Zn в ее составе (см. рис. 41), так называемый цинковый палец, обеспечивающий прикрепление к ДНК.

У эукариот основная масса РНК синтезируется в ядре клетки, где локали­зация биосинтеза различных видов РНК также различается (рис. 86).

Рис. 86. Локализация биосинтеза различных видов РНК в ядре клетки

Все виды РНК синтезируются на ящерной ДНК в качестве матрицы. В ядрышке сосредоточена рДНК, являющаяся матрицей в биосинтезе предшественников рибосомальных нуклеино­вых кислот (45S РНК), при созревании которых возникают 18S и 28S рРНК (короткими стрелка­ми подчеркивается многоступенчатость процес­са превращения предшественников в функцио­нальные РНК). рДНК в определенные периоды клеточного цикла многократно реплицируется, что обеспечивает наработку большего количест­ва рДНК (на рисунке это отмечено трехкра­тным повторением зоны рДНК в ядрышке). Все новообразованные РНК выходят в виде нуклеопротеинов через поры ядерной мембраны, в цитоплазму, где рРНК используется для об­разования 40S и 60S субчастиц рибосом, а мРНК, 5S рРНК в тРНК — при превращении неактивных рибосом в активные, транслирую­щие рибосомы

Биосинтез РНК осуществляется при посредстве РНК-полимераз, которые в основном являются ДНК-зависимыми и лишь в некоторых случаях РНК-зависимыми ферментами. Механизм их действия во многом совпадает с таковым у ДНК-полимераз: они ускоряют биосинтез РНК из АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ тоже путем нуклеотидилтрансферазной реакции. Обеспечение уникаль­ной первичной структуры новообразуемой РНК происходит за счет спарива­ния соответствующего рибонуклеозидтрифосфата с комплементарным ему нуклеотидным остатком матричного полинуклеотида в точке роста молекулы РНК. Но есть существенные различия: РНК-полимеразы не нуждаются в прай­мере, обладают способностью избирательно взаимодействовать с зоной про­мотора ДНК (точка, с которой начинается биосинтез РНК), являются сложными молекулами, построенными из нескольких субъединиц, и др.

Наиболее изучены РНК-полимеразы прокариот, в частности кишечной палочки. РНК-полимераза кишечной палочки, представленная белком с М = 487 000, состоит из пяти субъединиц: двух а, одной ß, одной ß' и одной σ. Форма субъединиц, их молекулярные массы и вероятный вариант ком­поновки показаны на рис. 46.

В целом же у прокариот (изучено несколько десятков видов) молекулярные массы РНК-полимераз колеблются в довольно широких пределах (а: 36—45 кДа, ß: 86—160 кДа, ß': 96—175 кДа и σ-фактор: 44—107 кДа). Прокари­отические РНК-полимеразы синтезируют все виды РНК — рибосомальные, матричные, транспортные и низкомолекулярные. В отличие от них эукари­отические РНК-полимеразы типа I (М = 473 кДа, 6 субъединиц) транскрибиру­ют гены рРНК; типа II (М = 882 кДа, 10 ±2 субъединицы) — гены, кодирующие

белки; типа III—гены малых стабильных РНК (тРНК, 5S рРНК) (М~653 к Да, 9 субъединиц). Каждая из субъединиц РНК-полимераз выполняет свою функ­цию: одни из них узнают нуклеотидную последовательность в зоне промото­ра, обогащенную тимидиловыми и адениловыми дезоксирибонуклеотидами (ТАТААТ — блок Прибнова у прокариот, ТАТА — блок Гольдбер­га—Хогнесса у эукариот), другие обеспечивают нуклеотидилтрансферазную реакцию при наращивании цепи РНК, третьи — взаимодействуют с многочис­ленными транскрипционными белковыми факторами (их насчитывают уже несколько десятков), регулирующими биосинтез соответствующих РНК путем контакта с энхансерными (усиливающими) и сайленсерными (ослабляющими) полинуклеотидными зонами ДНК или путем аткивирования протеинкиназ, фосфорилирующих как белковый кор РНК-полимераз, так и регуляторные белки. Транскрипционный процесс завершается либо факторнезависимым спо­собом (в составе синтезируемой РНК поблизости от ее конца появляются две короткие последовательности, дающие шпильку, что выводит РНК из транс­крипционной вилки), либо при посредстве белкового фактора р (М = 46094 Да, первичная структура выяснена, существует в виде гексамера в количестве 1000 молекул на клетку), который присоединяется к транскрипционному центру, распаривает ДНК—РНКовый комплекс и высвобождает РНК. Для РНК-полимеразы I, осуществляющей транскрипцию рРНК, сигналом для ее завер­шения служит присоединение белкового фактора (М= 130 кДа) к 18-звенному терминатору в составе копируемого гена рДНК млекопитающих.

РНК-полимераза преимущественно связывается с тяжелой цепью ДНК и об­ладает способностью расплетать биспиральную структуру ДНК на ее ограничен­ном протяжении. Перемещение РНК-полимеразы вдоль цепи РНК происходит под воздействием присоединяемого в процессе синтеза РНК нуклеотида. Биосин­тез РНК регулируется при посредстве механизма, показанного на рис. 87.

Синтезированные РНК представляют собой РНК-предшественники функ­ционально-активных рибонуклеиновых кислот, так как наряду с информатив­ными зонами содержат неинформативные участки. Впервые это явление было открыто в начале 60-х годов Г. П. Георгиевым и О. П. Самариной, а сами эти гигантские транскрипты названы ими дРНК (т.е. ДНК-подобными РНК). В дальнейшем происходит процесс их видоизменения, сопровождающийся разрушением неинформативных зон. Он носит название процессинга или созре­вания РНК. При процессинге РНК метилируется (с помощью РНК-метилаз), в результате чего она обогащается минорными основаниями (особенно в слу­чае тРНК); в случае мРНК к ней присоединяются кэп и полиаденилатный фрагмент. Процессинг идет при участии разнообразных ферментов. Именно при изучении процессинга предшественников РНК было открыто удивитель­ное явление: способность некоторых низкомолекулярных РНК осуществлять каталитическую функцию.

Наиболее отчетливо это выявилось при работе с РНКовой компонентой рибонуклеазы Р — фермента, катализирующего процессинг 5'-концов предшест­венников тРНК: будучи отделена от белковой части, РНК оказалась способной одна ускорять реакцию распада фосфодиэфирной связи по гуаниловому остатку при переходе предшественника в зрелую тРНК (рис. 88, А), вследствие чего получила название рибозима. Механизм каталитического акта пока не ясен, но зафиксировано образование рибозим-субстратного комплекса и полное подчи­нение процесса ферментативной кинетике. Возможен и аутосплайсинг предшест­венников (рис. 88, Б), где тоже решающую роль играют гуанозиновые остатки. В последние годы предприняты попытки по замене рибонуклеотидов в составе рибозимов на дезоксирибонуклеотиды, что привело к созданию химерных рибозимов (нуклеозимов) с повышенной стабильностью и активностью, а также по синтезу рибозимов и нухлеозимов с меньшим числом нуклеотидных звеньев в их составе (минизимов). Все это позволило создать концеп­цию, согласно которой имен­но рибонуклеиновые кислоты занимали центральное место в химических процессах, свя­занных с происхождением жизни на Земле, лишь потом к ним добавились ДНК и бел­ки, и постепенно возникла бо­лее прогрессивная система хранения и передачи инфор­мации при новообразовании биополимеров, обеспечиваю­щая передачу из поколения в поколение структурных осо­бенностей и функций биологических макромолекул.

Рис. 87. Регуляция биосинтеза РНК

Биосинтез РНК начинается с зоны молекулы ДНК, называемой промото­ром и «узнаваемой» σ-фактором; между промотором и информативной последовательностью нуклеотидных остатков (цистрон) в ДНК распола­гается зона оператора. Если она свободна, т. е. не занята белком-репрес­сором (его структура детально изучена), РНК-полимераэная реакция осу­ществляется беспрепятственно. Сначала транскрибируется зона операто­ра, затем зона цистрона, содержащего информацию о последовательности аминокислотных остатков в одном или нескольких метаболически связан­ных белках. Если промотор блокирован белком-репрессором, синтез РНК не происходит; зона связывания (энхансер) белка-активатора (тоже полно­стью охарактеризован) может располагаться не только вблизи, но н в от­далении от зоны промотора

Выяснилось далее, что аналогичной способностью обладают многие малые ядерные РНК, существующие в виде комплексов с белками. Все они содержат много остатков уридиловой кислоты и получили поэтому шифр U₁, U₂ и т. д. РНК. Их изучено более десятка, и большинство из них принимают участие в каталитическом ускорении созревания мРНК и рРНК, обеспечивая выщепление неинформативных фрагментов из их предшественников и соединение (сплайсирование) биологически значимых последовательностей с образованием зрелых молекул. Они же, по-видимому, ведут альтернативный сплайсинг предшественников мРНК, при котором из одной пре-мРНК образуется несколько функционально значимых мРНК за счет разного расположения информативных зон в их составе. Внутриядер­ные комплексы низкомолекулярных ядерных РНК с белковыми факторами, необходимыми для их сборки и функционирования, получили название сплайсосом; именно они осуществляют специфический сплайсинг при созревании пре-мРНК и пре-рРНК. Сейчас на первый план при оценке функций малых ядерных РНК выступает их ведущая роль в регуляции обмена веществ в клетке: открыт новый класс их, представители которого комплементарны коротким диспергированным повторам в ДНК, вследствие чего они могут контролировать репликацию ДНК и ее транскрипцию в качестве транс-регуляторных элементов, взаимодействующих с энхансерами и сайленсерами промоторной зоны.

Осуществлены подсчеты скорости синтеза РНК. Так, в случае биосинтеза в клетках печени крысы мРНК для сывороточного альбумина она равна 90—100 н. о./с. Исходя из того, что в печеночной клетке содержится около 40000 молекул этой мРНК, а время ее жизни составляет 3 ч, при указанной скорости биосинтеза достаточно 3—4 активных генов для того, чтобы полно­стью обеспечить наработку ее необходимого количества.

Изучение закономерностей биосинтеза нуклеиновых кислот привело к от­крытию важнейшего механизма воспроизведения специфичности при их ново­образовании. Механизм этот сводится к взаимодействию комплементарных оснований полинуклеотидной матрицы (на которой идет специфический син­тез) и нуклеозидтрифосфатов, из которых указанный синтез осуществляется. Таким образом, принцип комплементарности оказался ведущим не только в строении нуклеиновых кислот, но и в их биосинтезе. Как будет показано ниже, этот принцип имеет огромное значение при специфическом воспроиз­ведении первичной структуры белковых молекул. Взаимодействие комплемен­тарных структур, обеспечивающее воспроизведение специфического строения макромолекул при их биосинтезе, — один из важнейших законов, сформулиро­ванных в биохимической науке за последние годы. Вместе с тем матричный, комплементарный механизм биосинтеза макромолекул, с полным правом, мож­но отнести к элементарным, фундаментальным свойствам живой материи. Матричный принцип биосинтеза — это специфика химизма живого. Так, моле­кулярная биология и биохимия пришли к крупнейшему обобщению, которое конкретно характеризует специфику живого, отличие живого от неживого на молекулярном уровне.

Рис. 88. Процессинг пре-РНК:

А — пре-тРНК при участии рибозима; Б — пре-рРНК: путем аутосилайсинта (сплошная линия — функцио­нальная зона; волнистая — неинформативный фрагмент; рГ-гуансзии). Остальные пояснения в тексте