Основы биохимии - Филиппович Ю. Б. 1999

Обмен белков
Биосинтез белков

Проблема биосинтеза белка — одна из двух наиболее важных и острых проблем современного естествознания: если в неживой природе принципиаль­но новые пути получения энергии будут найдены благодаря успехам физики элементарных частиц, то в живой природе решение кардинального вопроса управления самой жизнью может быть получено в результате познания химии и биологии белковых тел.

В изучении строения и биосинтеза белка, как в фокусе, скрещиваются пути решения важнейших вопросов биологической науки: выяснение законов наслед­ственности и изменчивости, управление ростом и развитием организмов, выявление причин возникновения и разработка методов лечения многих болез­ней и т. п. Вполне закономерно поэтому, что XX в. физики называют веком атома, а биохимики — веком белка.

Биосинтез белков в организме осуществляется весьма интенсивно. Средняя скорость сборки полипептидных цепей в клетках бактерий составляет 16—17 аминокислотных остатков в 1 с, дрожжей — 7—10, млекопитающих — 5—7. Время синтеза (в с) молекулы глобина в ретикулоцитах кролика равно 20, овальбумина в яйцеводах курицы — 80; суммарных белков в печени крысы — 80. За 1 мин в ретикулоците кролика синтезируется 5 ∙ 10⁴ молекул глобина, в клетке яйцеводов курицы — 6 ∙ 10⁵ молекул овальбумина, в гигантской клетке заднего отдела шелкоотделительной железы тутового шелкопряда — 38 ∙10¹¹ молекул фиброина шелка.

История развития представлений о механизме биосинтеза белков. Путь, пройденный при разработке одной из центральных проблем современной биохимии — механизма биосинтеза белков, крайне поучителен и противоречив.

Первой по времени была гипотеза обращения протеолиза. Она восходит к концу прошлого столетия. В 1886 г. А. Я. Данилевский наблюдал образова­ние белковоподобных веществ при действии ферментов желудочного сока на концентрированный раствор пептонов, возникших в результате расщепления белка пепсином. Позже был расширен круг ферментов, способных к обраще­нию протеолиза (трипсин, пепсин, папаин, катепсины), и белков, с неполными гидролизатами которых такое обращение удавалось осуществить (альбуми­ны, глобулины, фибрин, казеин и др.). Продукты, возникающие в результате обращения реакции гидролиза белков, назвали пластеинами.

Хотя сейчас ясно, что реакции пластеинообразования не имеют отношения к природному биосинтезу белков, они вплоть до сегодняшнего дня привлекиют внимание исследователей, так как нашли практическое применение при переработке непищевых белков в пищевые и синтезе пептидов, в частности аспартама (метиловый эфир L-а-аспартил-L-фенилаланина), используемого как заменитель сахарозы (он в 100 раз слаще нее) в кондитерской промыш­ленности (коммерческое название — сластилин):

Определенный вклад в развитие современных представлений о механизме биосинтеза белков внесли исследования биосинтеза квазипептидных связей (т. е. не истинных пептидных связей, но близких к ним), осуществленные в 50-е годы в ряде лабораторий, в том числе у нас в лаборатории А. Е. Браунштейна. Будучи проведены на таких соединениях, как глутамин, ацетанилид, глутатион и гиппуровая кислота, эти исследования доказали ферментативный характер реакций их образования, необходимость энергообеспечения за счет окисли­тельных процессов и, что самое важное, участие в биосинтезе квазипептидных связей АТФ.

Столь же существенными оказались результаты разработки гипотезы транспептидирования в качестве возможного варианта механизма биосинтеза пептидных связей. В нашей стране исследования в этом направлении интенсив­но проводились в 50-е годы В. Н. Ореховичем с сотр. При изучении реакций транспептидирования впервые было показано, что перенос аминоациальных или пептидильных группировок на аминогруппу аминокислот может проис­ходить не только с амидной или пептидной связи, но и со сложноэфирной связи. В дальнейшем оказалось, что именно этот механизм лежит в основе реакции транспептидирования в рибосоме.    

Гипотеза подстаиовки аминокислот, возникшая в тот же период в связи с внедрением в биохимию метода радиоактивных индикаторов, не оказала сколько-нибудь существенного влияния на развитие представлений о механиз­ме биосинтеза белков.

Переломным моментом в развитии подходов к выяснению механизма биосинтеза белковых тел было установление сцепленности его с биосинтезом РНК (Ж. Браше, 1941; Т. Касперсон, 1941). Оно привело к созданию матричной схемы биосинтеза белков, являющейся фундаментом современных представле­ний в этой области. Матричный механизм биосинтеза полимеров, обеспечи­вающий безошибочное воспроизведение их первичной структуры, представля­ет одну из наиболее специфических черт живого. Он является превосходным примером тех принципиально новых закономерностей, которые сопровожда­ют возникновение и развитие биологической формы движения материи: малоэффективный механизм обычного химического синтеза, основанного на беспо­рядочном столкновении молекул, заменен здесь направленным, специфиче­ским синтезом на шаблоне; скорость его в миллиарды раз превышает таковую в неупорядоченных системах.

Принципиальное значение в разработке вопроса о механизме биосинтеза белков имело выявление локализации его в рибосомальном аппарате клетки и создание бесклеточных систем, где единственной структурой, на которой протекал биосинтез белка, были рибосомы (см. с. 280). Выяснение их строения и функции принесло неоценимую информацию об этапах матричного биосин­теза белка и тончайших молекулярных механизмах, которые ему сопутствуют.

Рис. 93. Общая схема матричного биосинтеза белковых тел (пояснение в тексте)

Как будет показано ниже, наряду с матричным механизмом в природе существует мультиэнзимный путь биосинтеза белков и пептидов, где специфи­ческое чередование аминокислот обеспечивается расположением каталитиче­ски активных белков в мультиэнзимном комплексе.

Матричный механизм биосинтеза белков. Общая схема матричного биосин­теза белковых тел представлена на рис. 93. Она складывается из трех подгото­вительных процессов — переноса вещества, энергии и информации в рибосому, и главного центрального процесса — сборки полипептидных цепей в рибосоме. Один из элементов указанной схемы (правая верхняя часть рисунка) — транс­крипция (переписывание) информации о порядке расположения аминокислот­ных остатков в молекуле синтезируемого белка — рассмотрен ранее. Известно, что информация об этом закодирована в генетическом аппарате клетки после­довательностью дезоксирибонуклеотидных остатков в молекуле ДНК. Будучи преобразована (транскрибирована) в последовательность рибонуклеотидных остатков в информативной части молекулы мРНК, синтезированной на ДНК в качестве матрицы, эта информация о первичной структуре белка поступает в рибосому. Здесь она переводится (транслируется) с полинуклеотидной после­довательности в аминокислотную последовательность новообразуемого в рибосомальном аппарате белка. Два других процесса — перенос вещества (18 протеиногенных аминокислот и двух амидов) и перенос энергии, необ­ходимой для синтеза пептидных связей (левая верхняя часть рисунка), равно как и наиболее сложный процесс — сборка полипептидной цепи в активной, транслирующей рибосоме (центральная часть рисунка), нуждаются в деталь­ной характеристике. Она дана ниже.

Активирование аминокислот и перенос их в рибосому. Син­тез пептидной связи из свободных аминокислот протекает с поглощением энергии в количестве около 12 кДж/моль. В связи с этим давно уже была высказана идея о сопряженности биосинтеза белка с окислительными процес­сами (А. В. Благовещенский, М. П. Юргенсон, 1937) или с распадом соедине­ний, содержащих макроэргические связи (Ф. Липман, 1941). Развитие послед­него направления привело к обнаружению ферментативного процесса активиро­вания аминокислот. В 1955 г. М. Хогленд впервые предложил общепринятую сейчас двухэтапную схему этой реакции.

Первый ее этап состоит во взаимодействии аминокислоты с АТФ, в резуль­тате чего возникает аминоациладенилат и выделяется пирофосфат. Гидролити­ческий распад последнего при участии пирофосфатазы обеспечивает необ­ратимость реакции образования аминоациладенилата. Химизм реакции этого этапа активирования аминокислот рассмотрен ранее (гл. III) при характерис­тике лигаз, катализирующих синтез С—О-связей (см. с. 137). Второй этап сводится к переносу аминокислоты с образовавшегося аминоациладенилата на концевой аденозин акцептирующего стебля тРНК:

Как видно из структурной формулы аминоациладенилата, он представляет ангидрид аминокислоты и остатка фосфорной кислоты аденозин-5'-фосфата, причем донором кислорода для ангидридной связи является ОН-группа карбок­сила аминокислоты. Будучи ангидридами, свободные аминоациладенилаты с исключительной легкостью вступают в реакцию с аминокислотами даже при очень небольшой концентрации (10^-3 моль), при почти нейтральной реакции среды (pH 7,4). Реакция осуществляется без участия ферментов и сопровождается образованием пептидных связей. Столь же энергично они ацилируют свободные, доступные аминогруппы белковой молекулы. В то же время в связанном с ферментом состоянии аминоациладенилаты крайне инертны, и об их использо­вании для синтеза белка прямо из состава комплекса не может быть речи.

Специфичность реакции активирования аминокислот по вышеуказанной схеме близка к абсолютной. Ее оценивают как сверхспецифичность. Активиру­ются изомеры аминокислот только природного L-ряда; D-изомеры аминокис­лот в реакцию не вступают. Однако некоторые гомологи L-аминокислот активируются наряду с белковыми L-аминокислотами.

Каталитическое ускорение активирования каждой протеиногенной амино­кислоты осуществляется собственным, специфичным только для данной амино­кислоты ферментом. Эти ферменты обнаружены у представителей различных классов животных, растений (в том числе водорослей) и микроорганизмов, т. е. они распространены повсеместно. Это указывает на их важнейшую роль в биосинтезе белков.

Активирующие ферменты изолируют при низкой температуре из так назы­ваемой рН5-фракции надосадочной жидкости. Последнюю получают после ультрацентрифугирования разведенного гомогената клеток при 105 000 g в те­чение 1 ч, в результате чего все структурные элементы клеточного содержимо­го осаждаются. При подкислении надосадочной жидкости СН₃СООН (НСl денатурирует ферменты) до pH 5,3 из нее выпадает осадок, содержащий смесь активирующих аминокислоты ферментов. Поэтому первоначально их назы­вали рН5-ферментами. В соответствии с современной номенклатурой их называют аминоацил-тРНК-синтетазами (АРСазами).

Из работ последних лет следует, что аминоацил-тРНК-синтетазы в клетках существуют в виде высокомолекулярных комплексов — кодосом. При констан­те седиментации 26—29S и М~1,4 мегаДа эти комплексы включают несколь­ко АРСаз (специфичных, например, к ала, гли, глу, лей и сер или к лиз, мет, арг, лей и три) и ферменты, модифицирующие АРСазы и регулирующие их активность — протеинкиназы, метилтрансферазы, АДФ-рибозилтрансферазы, фосфопротеинфосфатазы и др.

Ферменты, активирующие аминокислоты, исключительно лабильны, они легко денатурируются с потерей активности. Даже разрушение клеток ультра­звуком при выделении энзиматического препарата и непродолжительное хра­нение ведут к их инактивации. Для нормальной деятельности активирующих аминокислоты ферментов необходимо присутствие в реакционной среде Mg²⁺, так как связывание АТФ идет по имидазольному радикалу гистидина активного центра фермента через ион магния.

Молекулярные массы большинства АРСаз (их выделено в высокоочищен­ном состоянии более 50) близки к 100000, хотя в отдельных случаях достигают 200 000 и более (глицил- и фенилаланил-тРНК-синтетазы). Молекулы у боль­шей части АРСаз являются димерами или тетрамерами (иногда — тримерами) и лишь у единичных АРСаз (например, у аланил-, аргинил-, аспартил-, валил­и изолейцил-тРНК-синтетаз) представлены одной полипептидной цепью, включающей примерно 1000 аминокислотных остатков. Характерно, что у АРСаз с димерной структурой субъединицы работают сопряженно: высво­бождение синтезированной аминоацил-тРНК с одной из них происходит в тот момент, когда к другой вслед за АТФ и аминокислотой присоединяется тРНК. Следовательно, каждая субъединица в молекуле АРСазы обладает тремя структурно обособленными центрами связывания перечисленных субстратов, причем посадка каждого предшествующего субстрата облегчает акцептирова­ние последующего. Поэтому в процессе аминоацилирования тРНК легко возникают тройные фермент-субстратные комплексы. Наименее прочно с АР­Сазами связывается АТФ (K_s = 10^-4 моль), на порядок лучше — аминокислоты (K_s = 10^-5моль) и наиболее мощно — тРНК (К_s = 10^-8моль). АРСазы — са­мые «медленные» ферменты; их молекулярная активность составляет от не­скольких десятков до нескольких сотен каталитических актов в 1 мин.

Исходя из изучения различными методами активных центров АРСаз и ис­следования кинетики ускоряемых ими реакций активирования аминокислот, начал проясняться механизм их действия. Первой к АРСазе присоединяется АТФ, аденилирующая остаток гистидина в активном центре фермента с выде­лением пирофосфата:

С аденилированной АРСазой взаимодействует активируемая при ее по­средстве аминокислота, в результате чего возникает аминоациладенилат. По­следний, обладая выдающейся способностью аминоацилировать любые ради­калы, содержащие подвижный атом водорода, передает аминоацильную груп­пу на радикал гистидина активного центра АРСазы, в результате чего образуется аминоацилированный фермент:

После связывания ферментом соответствующей тРНК аминоацильная группа передается на ОН-группу остатка аденозина ее акцептирующего конца (уравнение реакции см. с. 281). У некоторых АРСаз роль остатка гистидина в осуществлении приведенных выше этапов активирования аминокислоты может играть радикал глутаминовой кислоты.

При образовании фермент-субстратного комплекса из АРСазы и тРНК и та и другая претерпевают конформационные перестройки, облегчающие реакцию аминоацилирования. Однако самым существенным и интригующим моментом взаимодействия АРСазы и тРНК является их способность безоши­бочно узнавать друг друга в соответствии с абсолютной специфичностью к той или иной аминокислоте. По-видимому, она базируется на многоточечном взаимодействии фермента и тРНК, причем существенная роль в узнавании принадлежит антикодону тРНК.

Долгое время считали, что аминоацильная группа всегда присоединяется по ОН-группе 3'-углеродного атома рибозы концевого аденозина молекулы тРНК. Оказалось, что иногда эту же функцию может выполнять гидроксил 2'-углеродного атома остатка рибозы. Это наблюдается при активировании фенилаланина, лейцина и изолейцина при участии соответствующих АРСаз. В противоположность этому серил- и треонил-тРНК-синтетазы обеспечивают присоединение аминоацильных групп только по 3'-углеродному атому рибозы, а тирозин- и цистеин-тРНК-лигазы — по 2'- и по 3'-углеродным атомам. Установлено также, что аминоацильная группа в аминоацил-тРНК способна перемещаться от 2'- к 3'-углеродному атому рибозы и наоборот, вплоть до установления равновесия:

Полагают, что аминоацилирование тРНК либо в 2'-, либо в 3'-положении остатка рибозы концевого аденозина' предупреждает от ошибок при активиро­вании стереохимически близких аминокислот (например, валина и треонина). Впрочем, если даже ошибка произошла, т. е. вместо специфической для дан­ной тРНК аминокислоты к ней присоединилась какая-то иная, АРСаза может исправить ошибку сама, так как обладает способностью гидролизовать чуж­дые ей неспецифические аминоациладенилаты.

Таким образом в процессе активирования неуклонно обеспечивается строго избирательное присоединение каждой аминокислоты к специфичной для нее тРНК и создание набора аминоацил-тРНК, непосре­дственно поставляющих энергетически обогащенные аминокислотные остатки в рибосому.

То, что это действительно так, т. е. что аминоацил-тРНК являются единственным источником аминокис­лотных остатков при биосинтезе белка, доказано в опытах с аминоацил-тРНК, содержащими ¹⁴С-аминокислоты: по мере инкубации в белоксинтезирующей системе содержание меченой аминокислоты в препара­те аминоацил-тРНК падает, но в такой же пропорции зеркально возрастает в синтезируемом белке (рис. 94).

Активирование аминокислот сопровождается их кодированием (шифрование): после присоединения к соответствующей тРНК аминокислота получает код, или шифр, в виде строго специфичного только для данной аминокислоты чередования трех нуклеотидных остатков в антикодоновой петле тРНК (см. с. 216). Этот триплет оснований называется антикодоном. Ему соответствует комплементарный кодон в составе мРНК. Взаимодействие кодонов мРНК с антикодонами аминоацил-тРНК предопределяет порядок чередования аминокислотах остатков в синтезируе­мом по матричной схеме белке. Это принципиально важное положение доказа­но экспериментально и известно как «опыт Шапвиля» (по имени одного из ученых, участвовавших в его проведении). В этом опыте цистеинил-тРНК путем восстановления по аминоацильному остатку была превращена в аланил-тРНК:

Рис. 94. Доказательство включения ¹⁴С-лейцина в белок (1) из состава ¹⁴С- лейцил-тРНК (2) поясне­ние в тексте)

Синтезированная так аланил-тРНК^цис содержит остаток аланина, присое­диненный к тРНК, несущей антикодон цистеина. Когда ее ввели в белоксин-тезирующую систему, в полипептидной цепи образующегося белка позиции цистеина оказались занятыми остатками аланина. Это однозначно указывает на то, что именно тРНК кодирует вступление соединенного с ней аминоациль­ного остатка в заданное положение в новообразуемой белковой молекуле. Поэтому аминоацил-тРНК-синтетазы одно время называли кодазами или шифразами; однако комиссия по номенклатуре ферментов не рекомендовала использовать эти термины, и их сейчас не употребляют.

Матричный механизм сборки полипептидной цепи. Биосин­тез белков во всех структурных элементах клетки (ядро, митохондрии, хлоро­пласта, эндоплазматический ретикулум и др.) идет на рибосомах. Поэтому именно на пути исследования структуры и свойств рибосом, а также механиз­ма их взаимодействия с исходными для биосинтеза белков соединениями достигнуты наиболее впечатляющие результаты в выявлении закономерно­стей новообразования белковых тел.

Строение и свойства рибосом. Рибосомы — мельчайшие тельца рибонуклеопротеиновой природы. Они содержатся в основном в цитоплазме растительных, животных и бактериальных клеток в количестве нескольких десятков тысяч в каждой.

Рибосомы выделяют путем дифференциального центрифугирования кле­точного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см. гл. I). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматиче­ской сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осажда­ются вместе с обломками липопротеиновой мембраны — микросомами.

Для выделения рибосом микросомы обрабатывают дезоксихолатом — ре­агентом, растворяющим липиды и, следовательно, разрушающим микросо­мы; затем рибосомы осаждают в изотонических буферных растворах центри­фугированием при 100000 g в течение 1 ч. При разрушении других субклеточ­ных частиц (ядра, пластиды, митохондрии) из них также могут быть выделены рибосомы. В настоящее время выделение рибосом осуществлено из многочис­ленных объектов — представителей животного и растительного мира, а также микроорганизмов. Форма и структура рибосом, выделенных из разных источ­ников, сходна, но по значению константы седиментации их делят на два класса: 70S и 80S. Первые найдены у всех прокариот, а также содержатся в ядрах, митохондриях и хлоропластах эукариот; вторые локализованы в ци­топлазме только эукариот.

70S и 80S рибосомы стабильны при концентрации Mg²⁺, близкой к 0,001 М. При повышении содержания Mg²⁺ до 0,01 М рибосомы дают димеры или слипаются в более крупные агрегаты, а при понижении до 0,0001 М диссоциируют на субчастицы: 70 (80)S⇄30 (40)S+50 (60)S. Этот про­цесс диссоциации — ассоциации рибосом и их субчастиц — контролируется также полиаминами (см. с. 211) и изменением концентрации других двухва­лентных катионов.

Будучи исключительно рибонуклеопротеинами (их называют также РНП-. частицами), рибосомы составлены из почти равных количеств РНК и белка, варьирующих в зависимости от класса рибосом (табл. 22) с определенно выраженной тенденцией к некоторому преобладанию в них белка.

Таблица 22 Состав рибосом

Кроме белков и нуклеиновых кислот, в составе рибосом в ничтожных количествах обнаружены другие вещества: Mg²⁺ и Со²⁺, ди- и полиамины, ряд других катионов (Fe³⁺, Zn²⁺, Al³⁺, Ва²⁺, Sr²⁺, Ni²⁺, Сr²⁺, NH₄), а также латентная рибонуклеаза.

Рибосомы в нативном состоянии, т. е. в живых клетках, сильно гидратиро­ваны: так, на 1 г сухого вещества рибосом из ретикулоцитов приходится 2,7 г гидротационной воды. Это свидетельствует об исключительно высокой «по­ристости» нативных рибосом.

Белок и РНК в рибосомных частицах соединены очень непрочными связями: уже при инкубации с 0,5—1 М растворами солей при низкой темпера­туре происходит отделение белка от нуклеиновой кислоты. Аналогичная диссоциация происходит, например, при pH 12 в условиях электрофореза. Связи белков с нуклеиновыми кислотами в рибосомах оценивают в основном как электростатические. Высокое содержание в суммарных рибосомальных белках основных аминокислот (12% лизина, 11 % аргинина и 3% гистидина), заряжен­ных положительно, и большое число межнуклеотидных фосфатов в рибосо­мальных РНК, заряженных отрицательно, обеспечивают условия для возник­новения достаточного количества ионных связей между первыми и вторыми.

Структура и функция рибосомальных высокомолекулярных (16—18 и 23—28S) и низкомолекулярных (5S и 5,8S) РНК рассмотрена ранее (см. гл. VI). Что касается структуры и функции рибосомальных белков, то об этом в последние годы получена существенная информация. Как видно из табл. 22, и малые (30—40S), и большие (50—60S) субчастицы рибосом содержат в своем составе строго определенное число белков, крайне гетерогенных по молекулярным массам. Белки, локализованные в малых (30—40S) субчастицах рибосом, обозначают буквой S (от англ. smoli — малый), в больших (50—60S) — L (от франц. large — большой).

Благодаря применению современных методов белковой химии все белки из рибосом кишечной палочки получены в высокоочищенном гомогенном со­стоянии, у всех у них определены первичные структуры, у многих из них — вторичные и третичные структуры. Как правило, молекулы рибосомальных белков асимметричны, характеризуются наличием значительного количества а-спиралей, глобулярны и ком­пактны (рис. 95). Некоторые из них, будучи обогащены гидро­фобными аминокислотами на тех или иных участках полипе­птидной цепи, легко образуют димеры и даже олигомеры, а также, взаимодействуя друг с другом, — ассоциаты в субча­стицах рибосомы.

Рис. 95. Третичные структуры белков S6, S8, S15, S16, S17 и L7 (А) и атомная модель белка L7 (Б):

спиральные участки представлены цилиндрами; ß-структурные — стрелками. В белке S6 N-концевой фрагмент 105—135 не обладает третичной структурой. В атомной модели рибосомального белка L7 цифрами обозначены номера N- и С-аминокислотных остатков в-спиральных фрагментов полипеп­тидной цепи, а овалом между а-спиралями 51—59 и 93—101—полость, в которую входят а-спираль 4—11 при образовании димера

Рис. 96. Пространственная структура 70S рибосомы кишечной палочки (модель):

30S-субчастица — спереди; се размеры: длила — ~23 им, ширина — 12 нм; 50S-субчастица — сзади; ее размеры во всех направлениях около 20— 23 нм; боковые выступы (палец — справа и боковая доля — слева) содер­жат белки L7/L12 и L1 соответственно. Субчастицы ассоциированы «го­ловка к головке» и боковой выступ к боковой доле («платформа к L- ребру»), 30S-субчастица закрывает только часть SOS-субчастнцы, оставляя свободным район, примыкающий к L7/L12-стержню, где, вероятно, раз­мещаются функционально важные центры рибосомы. По-видимому, при ассоциации 30S и 60S субчастиц в области впадины между головкой и телом 2 = 30S-субчастицы и основанием центрального протуберанца 50S-субчастицы возникает отверстие (зазор), предназначенное, как полагают, для размещения молекулы мРНК

В течение последнего деся­тилетия достигнуты большие успехи в выяснении простран­ственного строения рибосом в целом и локализации в их субчастицах отдельных структурных элементов (см. табл. 22). В этом отношении следует особо подчеркнуть за­слуги советской школы биохи­миков и, в частности, сотруд­ников Института белка в Био­логическом центре РАН (г. Пущино-на-Оке Москов­ской области) — здесь под ру­ководством акад. А. С. Спирина выполнены фундаментальные исследования рибосомального аппарата клетки. Топология рибосом представлена на рис. 96. Сейчас ясно, что основу пространственного строения рибосом задает третичная структура 16—18S и 23—28S рНК, предопределяющая форму и конструкцию 30—40S и 50—60S субчастиц рибосомы соответственно. Это особенно ярко выступает при анализе данных, полученных при выяснении строения 30S субчастицы рибосомы кишечной палочки А. С. Спириным и сотр. Оказалось, что морфологическая модель 30S субчастицы предопреде­ляется 16S рРНК, находящейся в компактной форме, с которой взаимодей­ствуют и располагаются на ней в определенных позициях белки S1—S21, найденные в этой субчастице (рис. 97). Аналогично построена 50S субчастица рибосомы кишечной палочки.

Принципиальное значение для понимания того, как в рибосоме идет синтез белка, имеют данные о локализации в ней центров, где осуществляются важнейшие этапы биосинтеза полипептидной цепи: связывание аминоацил-тРНК, связывание белковых факторов, необходимых для функционирования рибосомы, считывание информации о порядке расположения аминокислотных остатков в новообразуемом белке, синтез пептидной связи, удаление тРНК, высвобождающейся после образования пептидной связи, перенос пептидил-тРНК из аминоацильного центра в пептидильный центр с одновременным продвижением мРНК на один триплет нуклеотидных остатков, гидролиз сложноэфирной связи между полипептидом и тРНК в момент завершения синтеза белка в рибосоме и др. Поэтому рассмотрение современных представ­лений о структуре рибосомы логично завершить данными о функциональной модели рибосомы (Г. Виттман и др., 1974), где показаны ее функциональные центры (рис. 98).

Рис. 97. Пространственная структура 30S-субчастицы рибосомы кишеч­ной палочки:

А — морфологическая модель; Б — расположение белков и РНК в соответствии с моделью (белки, находящиеся на заднем плане, заштрихованы)

Рис. 98. Функциональная модель рибосомы 70S кишечной палочки

Инициация биосинтеза белка у бактерий происходит при участии трех белковых факторов инициации—IF-1, IF-2 и IF-3 (Initiation Factors 1, 2 и 3). IF-3 представлен белком с М = 21 000—23500. Он вызывает конформационные изменения в 30S субчастице рибосомы, способствующие связыванию ею IF-1, IF-2, ГТФ, мРНК и формилметионил-тРНК. Присоединение последней обес­печивает поступление в рибосомальный аппарат клетки первой, N-концевой аминокислоты, а именно — формилметионина, которым открывается полипеп­тидная цепь любого белка, синтезируемого у бактерий. Впоследствии N-концевой остаток формилметионина в результате посттрансляционных из­менений белка может отщепляться. тРНК, переносящая формилметионин в процессе белкового синтеза у бактерий, отличается от тРНК, осуществля­ющей перенос метионина в процессе сборки полипептидной цепи, т. е. сущест­вуют тРНК^фмет и тРНК^мет:

Именно IF-3 присоединяется первым к 30S субчастице рибосомы, открывая этап инициации белкового синтеза и изымая 30S субчастицу рибосомы из пула свободных 30S и 50S субчастиц рибосом, возникающих в процессе диссоци­ации рибосом 70S. Он же способствует созданию на субчастице 30S мРНК-связывающего центра.

IF-1 и IF-2 представляют белки с молекулярными массами 8900—9400 и 90000—118000 соответственно. IF-1 стимулирует процесс связывания фак­тора IF-2 с 30S субчастицей рибосомы и способствует присоединению к ней мРНК. IF-2 играет центральную роль в связывании формилметиониновой тРНК с субчастицей 30S и в гидролизе гуанозинтрифосфата. Последний необходим для осуществления инициации биосинтеза белка, хотя полностью его функция в этом процессе еще не выяснена.

Присоединение IF-1, IF-2, формилметионил-тРНК и ГТФ к 30S субчастице осуществляется в виде комплекса (см. рис. 99). Как только оно произойдет, к ней же присоединяется мРНК, причем в результате взаимодействия антикодона формил­метиониновой тРНК с кодоном мРНК (им является триплет АУГ) предопределя­ется такое расположение мРНК на рибосоме, которое обеспечивает далее считывание содержащейся в последовательности ее нуклеотидных остатков информации о первичной структуре синтезируемого белка. Таким образом, именно формилметиониновая тРНК помогает мРНК найти на 30S субчастице ту позицию, которая необходима для трансляции информации о последовательности амино­кислотных остатков в белке, и именно в этом заключается ее значение в инициации белкового синтеза у бактерий. У эукариот эту функцию часто выполняет тРНК^мeт, но опять специфичной структуры, которая отличается от структуры тРНК^мeт, переносящей остатки метионина в процессе элонгации белкового синтеза.

Вместе с тем сейчас показано, что гораздо большее значение для стабилизации необходимого расположения мРНК в 30S субчастице имеет присутствующая в ней три главных этапа матричного биосинтеза белка — инициация, элонгация и терминация — выделены рамками; белковые факторы инициации и элонгации указаны условными значками, приведенными непосредственно на схеме; часть условных обозначений дана отдельно в верхнем правом углу рисунка

последовательность Шайна—Дальгарно (короткая — ААГГА или длинная — УААГГАГГ), взаимодействующая с комплементарным фрагментом на 3'-конце 16S рРНК и находящаяся на расстоянии от 5 до 13 н. о. от стартового АУГ кодона.

Рис. 99. Схема биосинтеза белка у кишечной палочки (пояснение в тексте):

Присоединение мРНК к комплексу, состоящему из 30S субчастицы, факто­ров инициации и ГТФ сопровождается высвобождением фактора инициации IF-3, выполнившего присущую ему функцию (см. рис. 99). Комплекс, включа­ющий теперь в свой состав еще мРНК, жадно притягивает 50S субчастицу и соединяется с ней, образуя 70S рибосому, причем 1F-1 в этот момент покидает рибосому, так как он тоже выполнил свою ролы стабилизацию в рибосоме мРНК. Сохранившийся еще в возникшей 70S рибосоме IF-2, связанный с ГТФ, обеспечивает ускорение реакции распада ГТФ на ГДФ и неорганический фосфат и высвобождается из рибосомы вместе с продуктами гидролиза ГТФ. Выделяющаяся при гидролизе ГТФ энергия, видимо, необ­ходима для осуществления конформационных перестроек в рибосоме 70S, в результате чего формилметионил-тРНК стабилизируется в пептидильном центре рибосомы (см. 1-ю фазу элонгации на рис. 99). Такая рибосома способ­на теперь вести сборку полипептидной цепи белка заданной структуры, вслед­ствие чего ее называют транслирующей (активной) рибосомой. В транслиру­ющей рибосоме идет, следовательно, процесс элонгации белкового синтеза.

В клетках эукариот инициация рибосомального белкового синтеза идет тоже при участии эукариотических факторов инициации (eIF — eukaryotic Initiation Factors). Их насчитывается девять: eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4C, eIF-4D, cIF-5 и eIF-6. Все они, за исключением eIF-2 и eIF-3, представ­лены одиночными полипептидами с М от 15000 (eIF-І) до 160000 (eIF-5). Фактор eIF-2, по-видимому, является димером (М = 86000; а-субъединица — 38000; ß-субъединица — 48000); eIF-3 состоит из нескольких субъединиц при суммарной молекулярной массе более 500000.

Из девяти перечисленных белковых факторов абсолютно необходимы для инициации биосинтеза белка у эукариот eIF-2, eIF-3 и eIF-5, а остальные факторы усиливают функции этих трех. Фактор eIF-2 взаимодействует своей ß-субъединицей с метионил-тРНК, а а-субъединицей — с ГТФ, образуя комплекс с субчасти­цей 40S. Его деятельность контролируется фосфилированием а-субъединицы при участии специфической протеинкиназы. Фактор eIF-3 тоже присоединяется к субчастице 40S, что сопровождается возникновением на ней мРНК-связывающего центра и стабилизацией связи с нею комплекса eIF-2 ∙ метионил-тРНК ∙ ГТФ. После присоединения мРНК к субчастице 40S по мРНК-связывающему центру она, при участии фактора eIF-5, энергично притягивает 60S субчастицу, происходит выброс всех присоединенных ранее, в том числе и eIF-5, белковых факторов, гидролиз ГТФ и закрепление метионил-тРНК в пептидиль­ном центре возникшей активной, способной осуществлять трансляцию рибосо­мы 80S. Фактор eIF-6 обеспечивает диссоциацию 80S рибосомы на субчастицы 40S и 60S, высвобождая 40S субчастицу для нового цикла инициации.

Элонгация биосинтеза белка в бактериальной клетке обслуживается тремя белковыми факторами элонгации: EF-T_u, EF-T_S и EF-G (элонгационные факто­ры трансляции трех типов — w, s и G). У млекопитающих два фактора элонга­ции: TF-1 и TF2 (трансляционные факторы первый и второй). EF-Tu (М = 47 000) и EF-T_s(М = 35000) бактерий соответствует TF-1 (М = 186000) млекопитаю­щих, a EF-G бактерий—TF-2 (М = 70 000) млекопитающих. EF-G кишечной палочки имеет молекулярную массу 77321,45 и представлен полипептидом (701 аминокислотный остаток), первичная структура которого выяснена.

Процесс элонгации начинается со связывания аминоацил-тРНК, содержащей аминокислотный остаток, который должен быть вторым с N-конца молекулы синтезируемого в рибосоме белка. У бактерий эта аминоацил-тРНК образует комплекс с EF-T_u и ГТФ, в виде которого она присоединяется к аминоацильному центру транслирующей рибосомы в соответствии с кодом белкового синтеза (см. ниже), т. е. благодаря взаимодействию комплементарных триплетов анти­кодона тРНК и кодона мРНК, локализованного против аминоацильного центра рибосомы (см. рис. 98 и 99). У млекопитающих это происходит при участии TF-1.

По современным данным, не только кодон — антикодоновое взаимодейст­вие предопределяет отбор соответствующих аминоацил-тРНК для сборки полипептидной цепи. В этом участвует вся молекула тРНК, так как посттран­сляционная модификация сильно изменяет ее способность акцептироваться рибосомой. В процесс декодирования вовлекаются и белки рибосомы: S4, S9, S13, L2 и L7. Два последних, будучи локализованы в пептидильном центре рибосомы, образуют с двумя молекулами тРНК тетрамерный комплекс.

И аминоацил-тРНК, и ГТФ связываются с EF-T_u за счет свободных HS-групп остатков цистеина его молекулы, причем первичная структура цент­ра связывания ГТФ (и ГДФ соответственно) на протяжении 42 аминокислот­ных остатков расшифрована. Активность EF-Т_u регулируется фосфорилирова­нием и взаимодействием с pplpp¹.

Благодаря расщеплению ГТФ на ГДФ и неорганический фосфат амино­ацил-тРНК сближается с формилметионил-тРНК, локализованной в пепти­дильном центре рибосомы, a EF-T_U в комплексе с ГДФ и неорганический фосфат выносятся из рибосомы. EF-T_u ∙ ГДФ-комплекс при взаимодействии с EF-T_S и ГТФ преобразуется в EF-T_u ∙ ГТФ-комплекс, способный соединяться со следующей молекулой аминоацил-тРНК (см. рис. 99).

В пептидильном центре между формилметионил-тРНК и аминоацил-тРНК происходит реакция, благодаря которой остаток формилметионина перено­сится на свободную NH₂-гpyппy аминокислотного остатка, являющегося со­ставной частью аминоацил-тРНК. В результате возникает дипептидил-тРНК, т. е. замыкается первая пептидная связь в будущей молекуле белка, а также образуется деацилированная тРНК^фмет (см: рис. 99). Этот процесс получил название реакции транспептидирования. Он ускоряется соответствующим фер­ментом, причем транспептидазная активность присуща рибосомным белкам L16, L11 и L6 и, вероятно, фрагменту 23S рРНК (см. рис. 98).

Пептидил-тРНК на следующей фазе элонгации переносится на место тРНК^фмет в пептидильном центре рибосомы, а последняя удаляется из него, перемещаясь в Е-центр рибосомы, из которого она затем вытесняется очеред­ной аминоацил-тРНК и выносится из рибосомы.

Эта ступень элонгации называется транслокацией и происходит при участии EF-G у бактерий и TF-2 у эукариот, а также сопровождается непременным гидролизом еще одной молекулы ГТФ (см. рис. 99). В результате транслокации дипептидил-тРНК занимает место в пептидильном центре рибосомы, тогда как ее аминоацильный центр полностью освобождается и готов теперь принять новую аминоацил-тРНК вкупе с EF-T_u или TF-1 и ГТФ. Особенно важно, что при транслокации пептидил-тРНК перемещается в пептидильный центр рибосо­мы вместе с молекулой мРНК, с которой она связана благодаря антикодон­кодоновому взаимодействию (см. рис. 98). Это перемещение идет точно на один триплет нуклеотидных остатков, т. е. напротив аминоацильного центра ока­зывается следующий по порядку кодон молекулы мРНК, предопределяющий, какая аминоацил-тРНК вступит в аминоацильный центр рибосомы и явит­ся источником очередного аминокислотного остатка в новообразуемом белке.

Терминация белкового синтеза в рибосоме осуществляется тоже при уча­стии трех белковых факторов: RF-1, RF-2 и RF-З у бактерий и единственного белкового фактора—R—у высших организмов (от англ. recognize — узна­вать). В клетке кишечной палочки насчитывается примерно по 500 молекул этих белков. Белковые факторы RF-1 и RF-2 имеют молекулярную массу по 45000 и способны распознавать в молекуле мРНК терминирующие сборку полипептидной цепи кодоны: фактор RF-1—УАГ и УАА, а фактор RF-2—ОДА и УІА. Фактор RF-З (его называют также S-протеин) стимулирует действие факторов RF-1 и RF-2.

Как только в аминоацильном центре рибосомы после очередной трансло­кации терминирующий кодон молекулы мРНК займет соответствующее ме­сто, к нему присоединяется один из факторов терминации RF-1 или RF-2.

¹ pplpp — 3'-пирофосфо-гуанозин-5'-пирофосфат.

Этим блокируется возможность присоединения молекулы аминоацил-тРНК, тем более, что терминирующим кодонам не соответствует ни один из антико­донов в тРНК. Присоединение к мРНК фактора RF-1 или RF-2 возбуждает пептидилэстеразную активность рибосомальных белков, в частности белков L11 и L16, локализованных в 50S субчастице (см. рис. 98), вследствие чего гид­ролизуется сложноэфирная связь между новообразованным полипептидом и тРНК. В результате синтезированный в рибосоме белок отделяется от нее. Одновременно освобождаются тРНК и мРНК, а рибосома 70S распадается на субчастицы 30S и 50S, поступающие в общий фонд рибосом и их субчастиц, откуда они черпаются для нового цикла биосинтеза белковой молекулы (см. рис. 99). В терминации биосинтеза белка по матричной схеме принимает участие молекула ГТФ. У бактерий она служит аллостерическим регулятором активности белковых факторов терминации, а у животных распадается на ГДФ и неорганический фосфат.

Долгое время считали, что у эукариот — единственный распознающий терминирующие кодоны фактор (eRF). Он был охарактеризован (50 кДа) и секвенирован. Однако недавно описана группа родственных ему белков, названных eRF1. Эти белки выделены из человека, лягушки и дрожжей, секвенированы (428, 437 и 437 аминокислотных остатков соответственно), взаимодействуют с тремя терминирующими кодонами и ГТФ-независимы, что делает контроль терминации биосинтеза белков более надежным:

Мулыиэнзимный механизм биосинтеза пептидов. Разработка мультиэнзим­ного пути биосинтеза пептидов осуществлена Ф. Липманом и сотр. (1968). В настоящее время доказано, что по меньшей мере 5 антибиотиков пептидной природы: грамицидин, тироцидин, бацитрацин, циклоспорин и микобациллин — синтезируются без всякого участия нуклеиновых кислот, в том числе и тРНК, но при этом обеспечивается безошибочная сборка полипептидных цепей, характеризующихся определенной первичной структурой.

Биосинтез грамицидина S осуществляется при посредстве мультиэнзимной системы, состоящей из двух белковых фракций с молекулярными массами 280 000 и 100 000. Они выделены из белкового экстракта Bacillus brevis, из которого при посредстве гельфильтрации через сефадекс G-200 удалось получить две взаимо­дополняющие друг друга упомянутые выше белковые фракции. Будучи соедине­ны вместе, в присутствии аминокислот, АТФ и Mg²⁺ они обеспечивают синтез in vitro циклического декапептида — грамицидина S (рис. 100).

Легкая белковая фракция (М = 100 000) рацемизирует и активирует D-фенилала­нин, а тяжелая (М = 280 000) — активирует 4 остальные L-аминокислоты. Активи­рование аминокислот указанными ферментами осуществляется путем образования на 1-м этапе аминоациладенилатов перечисленных аминокислот (по реакции между свободными аминокислотами и АТФ с выделением пирофосфата), а на 2-м — путем переноса аминоацильных групп с аминоациладенилатов на HS-группы остатков цистеина, содержащихся в полипептидной цепи самого фермента, с образованием тиоэфиров аминокислот. В таком состоянии легкая фракция, содержащая активиро­ванный по СООН-группе D-фенилаланин, будучи соединена с тяжелой фракцией, содержащей активированные по СООН-группам L-пролин, L-валин, L-орнитин и L-лейцин, инициирует последовательный биосинтез пептидных связей между перечисленными аминокислотами в том порядке, в каком они располагаются в молекуле грамицидина S. Непосредственно перенос остатка D-фенилаланина с его тиоэфирной связи (на легкой белковой фракции) на NH₂-гpyппy остатка L-пролина, соединенного тиоэфирной связью с субъединицей тяжелой белковой фракции, осуществляется аминоацилпроводящим белком (АПБ), присутствующим в мультиэнзимном комплексе. Это белок сравнительно небольшой молекулярной массы (около 20 000) с сантотеином в качестве простетической группы:

Остаток D-фенилаланина сначала переносится на HS-группу пантотеина, а затем с нее — на NН-гpyппy L-пролина. Так возникает первая пептидная связь в будущей молекуле грамицидина. Далее остаток дипептида D-фен-b- про поступает с тиоэфирной связи (с субъединицей тяжелой белковой фракции) на HS-группу пантотеина АПБ, а с нее — на NР-гpyппy остатка валина. Пептидилтрансферазная реакция повторяется до тех пор, пока не будет синте­зирован пентапептид D-фен→про→вал→орн→лей (см. рис. 100). Так как одно­временно на расположенном рядом идентичном мультиэнзимном комплексе синтезируется еще один такой же пентапептид, то они соединяются по типу «голова к хвосту» и образуют молекулу циклического декапептида — грамици­дина S (см. рис. 100).

В соответствии с рассмотренным выше механизмом идет биосинтез друго­го антибиотика пептидной природы — тироцидина:

Здесь мультиэнзимная система осуществляет полную сборку циклического декапептида, т. е. последовательно синтезируется 10 пептидных связей в соот­ветствии с первичной структурой пептида. Этот мультиэнзимный комплекс устроен сложнее, так как состоит из трех белковых фракций: 1) М = 100 000 — рацемизует (и активирует) D-фенилаланин; 2) М = 230 000 — активирует L- пролин; 3) М = 460 000 — активирует D-фенилаланин, аспарагин, глутамин, тирозин, валин, орнитин и лейцин, а также рацемизует фенилаланин.

Рис. 100. Мультиэнзимный механизм биосинтеза половины молекулы грамицидина (пояснение в тексте)

Недавно доказано, что при посредстве мультиэнзимного комплекса идет биосинтез микобациллина — циклического 13-членного пептида, бацитрацина А и циклоспорина А (оба — 11-членные циклические пептиды).

Ф. Липманом предпринята попытка связать матричную и нематричную схемы биосинтеза белков в единую концепцию. Хотя в последней выяснены не все детали, несомненно, что в эволюционном аспекте мультиэнзимный путь сборки полипептидов заданного строения предшествовал рибосомальному пути их биосинтеза, и сейчас у микробов сосуществуют оба пути. Весьма показательна аналогия в деятельности мультиэнзимных систем пептидного биосинтеза и функционирования синтетазы высших жирных кислот, что указы­вает на широкое использование в природе принципа мультиэнзимного биосин­теза достаточно сложных соединений.

Кодирование биосинтеза белка. Выяснение вопроса о том, какой именно триплет нуклеотидов в составе мРНК кодирует вступление в белок определен­ной аминокислоты, представляет одну из самых увлекательных страниц со­временной биохимии и молекулярной биологии.

Как перевести четырехбуквенный (по числу оснований, входящих в мРНК, т. е. А-аденин, Г-гуанин, Ц-цитозин и У-урацил) код в двадцатибуквенный (по числу аминокислот, составляющих белковую молекулу)?

Если каждой комбинации нуклеотидов в мРНК приписать способность кодировать положение одной аминокислоты в белке, то дуплетный код вряд ли возможен (число пар нуклеотидов менее числа постоянно встречающихся в белке аминокислот), квадруплетный нереален (число сочетаний слишком сильно превышает число аминокислот), в то время как триплетный код наиболее удовлетворяет численному соотношению возможных кодонов и бел­ковых аминокислот. Указанные расчеты основаны на том, что при соединении 4 нуклеотидов попарно можно получить 16 комбинаций, по три — 64, по четыре — 256 комбинаций и т. д.:

Посредством ряда остроумных опытов триплетная природа кода белково­го синтеза доказана экспериментально. Сначала был установлен качественный состав нуклеотидных остатков, которые входят в состав одного или несколь­ких кодонов, обеспечивающих вступление в состав белка той или иной амино­кислоты. Решающую роль здесь сыграло наблюдение М. Ниренберга (1961), который, используя в качестве мРНК полиуридиловую кислоту, впервые показал, что вступление в полипептидную цепь фенилаланина кодируется УУУ-триплетом. Полиуридиловая кислота, поли (У), вводилась им в белок-синтезирующую бесклеточную систему, составленную из промытых (лишен­ных мРНК) рибосом, полного набора тРНК, аминоацил-тРНК-синтетаз и ами­нокислот (некоторые из последних мечены ¹⁴С или ¹⁵N), АТФ и генерирующих ее соединений (фосфоенолпируват, ацетилфосфат и подобные им вещества), ГТФ, Mg²⁺ и Мn^2+. В этой системе на поли (У) в качестве матрицы шел синтез пептидов, составленных только из остатков фенилаланина. Благодаря применению в этой же системе почти полного набора синтетических гомо- и гетерополирибонуклеотидных матриц, полученных с помощью полинукле- отидфосфорилазы, в лаборатории С. Очоа в течение года была завершена работа по выявлению качественного состава кодонов для всех аминокислот.

Самую большую трудность представляло выяснение последовательности нуклеотидов в кодонах, определяющих положение аминокислоты в белковой молекуле: ведь при известном качественном составе кодона оставалось неясным, какое же чередование нуклеотидных остатков в нем (например, АЦУ, ЦАУ, УАЦ, АУЦ, ЦУA или УЦА) действительно кодирует данную аминокислоту при биосинтезе белка в рибосоме. Но и эта трудность была преодолена после того, как было обнаружено, что синтетические тринуклеотиды, подобно мРНК, могут специфически связывать аминоацил-тРНК с рибосомами, а в лаборатории Г. Корана были синтезированы полирибонуклеотиды заданного строения (с известной последовательностью ну­клеотидных остатков) и применены для экспериментального выявления в бесклеточных белоксинтезирующих системах первичной структуры ко­донов для каждой аминокислоты.

В результате уже к концу 1965 г. были получены полные данные о коде белкового синтеза в рибосомальном аппарате клетки (табл. 23). Как видно из таблицы, из 64 триплетов 61 кодирует последовательность вхождения амино­кислот в полипептидную цепь в процессе ее биосинтеза в рибосоме. Три триплета (УAА, УAГ и УГА) не участвуют в кодировании. Однако и они играют важную роль в биосинтезе белка. Именно эти триплеты распознаются белко­выми факторами терминации в тот момент, когда они окажутся (по мере продвижения мРНК через рибосому) в ее аминоацильном центре. А это, как известно, приводит к завершению синтеза белковой молекулы.

Таблица 23 Код белкового синтеза

Детальное изучение свойств кода белкового синтеза показало, что он является триплетным, непрерывным, неперекрывающимся, вырожденным и универсальным.

Триплетность кода доказана в результате проведения ряда целенаправлен­ных экспериментов. Среди них — сопоставление числа мутаций в геноме фага Т4 с появлением мутантов и их возвратом к исходному типу при обработке бактериофага химическим мутагеном — акридиновым оранжевым (Ф. Крик); выяснение минимальной длины фрагмента олигоуридиловой кислоты, способ­ного связать фенилаланил-тРНК (М. Ниренберг); синтез олигорибонуклеотидов заданного строения и изучение их кодирующих свойств при использовании в качестве мРНК в белоксинтезирующей бесклеточной системе (Г. Корана); анализ распределения аминокислотных замен в гомологичных белках (Г. Виттман).

Казалось бы, не осталось уже сомнений в том, что взаимодействие трипле­тов нуклеотидов (кодонов) в мРНК с триплетами нуклеотидов (антикодона­ми) в тРНК однозначно определяет связывание соответствующей аминоацил-тРНК с рибосомой. Однако в последнее время накопились факты, доказываю­щие, что существенное значение для кодирования имеют лишь два из трех нуклеотидных остатков в кодоне (У. Лагерквист, 1978). Так, в табл. 23, где сведены данные о коде белкового синтеза, легко заметить, что существуют семейства кодонов, отличающиеся только третьей буквой — именно она рас­познается в ряде случаев неоднозначно. Сначала для объяснения этого явления использовали представление о неполном соответствии правилу комплемен­тарности сочетания азотистых оснований в кодоне и антикодоне (wobble- гипотеза, т. е. гипотеза, допускающая «болтанку», неточную подгонку основа­ний). Сейчас все более придерживаются гипотезы два из трех. Таким образом, код белкового синтеза, по существу, является квазидуплетным (условно, мнимодупдетным).

Непрерывность кода белкового синтеза состоит в том, что все входящие в его состав кодоны располагаются в мРНК, кодирующей биосинтез опреде­ленного белка, в строгом порядке один возле другого, не будучи разделен­ными иными моно- или олигонуклеотидными вставками.

Неперекрывающийся характер кода белкового синтеза заключается в том, что ни один из нуклеотидов одного кодона не является составной частью другого (соседнего) кодона.

Вырожденность кода сводится к его множественности для тех или иных аминокислот. Из табл. 23 видно, что вступление в полипептидную цепь как лейцина, так и аргинина обеспечивается шестью различными кодонами; по­давляющего большинства других аминокислот — четырьмя или двумя кодона­ми и лишь в одиночных случаях (метионин и триптофан) — одним кодоном. Естественно, что вследствие вырожденности кода существуют соответствую­щие наборы тРНК, взаимодействующих с комплектом кодонов для данной аминокислоты.

Наконец, универсальность кода белкового синтеза определяется тем, что он един для всего живого на земле: от простейшего фага или бактерии що венца творения — человека и неизменен уже более 3 млрд. лет. Однако код белково­го синтеза в митохондриях существенно отличается от такового прокариот и эукариот и его происхождение остается загадкой. К тому же у реснитчатых и микоплазм он тоже отличается от канонического: терминирующие кодоны у них выполняют кодирующую функцию.

К перечисленным пяти свойствам кода следует добавить еще помехоустой­чивость, наличие в нем знаков пунктуации (инициирующие и терминирующие триплеты), серийносвязанность (см. серии кодонов в табл. 23), симметричность (поворот на 180° не нарушает расположения сильных и слабых оснований), сцепленность состава и расположения оснований в кодоне с полярностью и размерами аминокислот и, наконец, однозначность (каждый кодон соответст­вует единственной аминокислоте).

Всегда ли кодирование осуществляется с абсолютной точностью или воз­можно ложное кодирование и включение аминокислоты в полипептидную цепь не в соответствии со структурой кодона? Считают, что определенный уровень ложного кодирования запрограммирован эволюционно; и в тех случа­ях, когда вследствие мутации изменен один из кодонов в мРНК, он может транслироваться как неизменённый («ложь во спасение»). Это помогает клеткам, в том числе и бактериальным, выжить при неблагоприятных мутациях. Нали­чие ложного кодирования показано и в нефизиологических условиях, в опытах по синтезу пептидов в бесклеточных белоксинтезирующих системах. Так, на поли (У) наряду с массированным включением в полипептидную цепь фенила­ланина отмечено наличие в возникающих на этой матрице пептидах лейцина и изолейцина, а также в уменьшающихся количествах серина, тирозина и ва­лина. Ясно, что эти аминокислоты вступают в пептидную фракцию вследствие ложного кодирования, причиной которого является квазидуплетность (два из трех) кода белкового синтеза и возможность неполного соответствия кодона и антикодона в процессе трансляции (wobble-гипотеза!). Ложное кодирование усиливается при увеличении концентрации в среде Mg²⁺, путресцина, спермидина, этанола, а также при понижении pH и температуры инкубации. В физио­логических условиях его уровень составляет 10^-4—10^-3 ошибок на кодон и в определенной мере увеличивает жизненную гибкость и потенции клетки (синтез вариантов белков и т. п.). Вопросы ложного кодирования в процессе белкового синтеза успешно изучаются в Институте белка в Пущино под руководством акад. А. С. Спирина.

Проблема кодирования биосинтеза белков в последние годы обсуждается еще в одном принципиальном аспекте. Исходя из работ, в которых удалось доказать способность некоторых белков без участия нуклеиновых кислот обеспечивать собственное мультиплицирование, накопление и реализацию присущего им патологического (инфекционного) процесса, В. А. Кордюмом выдвинута концепция о существовании новой формы биологической инфо­рмации — пространственной структуры белка, способной к самовоспроизве­дению.