Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Токсины (белковые)
Бактериальные токсины

Экзотоксины. Экзотоксинами называются такие токсичные вещества, которые выделяются из бактериальных клеток, где они образуются, в окружающую среду или организм хозяина. Экзотоксины Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani удалось очистить и выделить в кристаллическом виде. Все токсины, обладающие резко выраженной токсичностью, являются белками типа глобулина.

Дифтерийный токсин очищают при помощи фракционированного осаждения сернокислым аммонием. Молекулярный вес очищенного токсина составляет 74 000, а отношение осей в его молекулах равно 4,7 : 1 [2]. Обработка формальдегидом приводит к потере токсичности, что указывает на существенное значение свободных аминогрупп токсина для его действия [3]. Дифтерийный токсин представляет собой глобулиноподобный белок, разрушающийся при нагревании и под действием протеолитических ферментов. Он легко соединяется с железом порфиринового кольца, и возможно, что именно он является белковым компонентом дыхательного фермента Corynebacterium diphtheriae [1].

Кристаллический столбнячный токсин получен путем осаждения метиловым спиртом при слегка кислой реакции, низкой ионной силе и температуре от —8° до —5° [4]. Этот токсин является очень лабильным глобулином с изоэлектрической точкой, лежащей при pH 5,1, и константой седиментации (s), равной 4,5. При длительном хранении он инактивируется даже при температуре 0° [5], превращаясь в нетоксичное, димерное, легко флоккулирующее соединение, которое, однако, сохраняет способность осаждаться соответствующим антителом [5].

Молекулярный вес кристаллического экзотоксина Clostridium botulinum равен приблизительно 1 000 000 [6, 7], его изоэлектрическая точка лежит при pH 5,6, а константа дисимметрии равна f/f₀ =1,45; отношение осей а/b достигает очень высокой величины, порядка 10 [6, 7]. В преципитате, полученном при осаждении токсина соответствующим антителом, отношение антиген/антитело не является постоянной величиной, несмотря на то, что токсин представляет собой, повидимому, однородное вещество; максимальное число молекул антитела, связываемых 1 молекулой антигена, достигает 60 [6].

Частичная очистка токсина Clostridium welchii [8] достигнута при помощи фракционирования сернокислым аммонием и этиловым спиртом. Этот токсин, повидимому, является a-лецитиназой, отщепляющей фосфорилхолин от лецитина или сфингомиелина [9]. Скарлатиновый токсин был выделен путем адсорбции на реактиве Ллойда с последующим извлечением щелочным буфером и осаждением из экстракта сернокислым аммонием. Токсин устойчив к непродолжительному нагреванию до 100° и не разрушается трипсином и пепсином; его молекулярный вес равен приблизительно 14 000, а изоэлектрическая точка лежит при pH 5,55. Для проявления действия этого токсина, так же как и для проявления действия дифтерийного токсина, существенное значение имеет наличие свободных аминогрупп [10, 11].

Механизм действия экзотоксинов до сих пор еще не выяснен. Некоторые из них имеют большое сродство к нервной системе и вызывают ее паралич. Летальная доза токсина ботулинуса, достаточная для того, чтобы убить одну мышь, равна 0,00005 у, или приблизительно 20 млн. молекул токсина [12]. Столь ничтожная величина указывает на то, что токсин действует как фермент [13], катализируя образование других токсических продуктов или пуская в ход какую-то цепную реакцию [12].

Токсины Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum и Clostridium tetani являются типичными антигенами. При инъекции этих веществ кроликам происходит образование большого количества антитоксинов, способных соединяться с токсинами и нейтрализовать их токсические свойства. Токсины и антитоксины нейтрализуют друг друга в определенных пропорциях, что дает возможность определять их количество путем титрования одного из этих соединений другим.

Грамицидин и тироцидин. Токсины этого типа отличаются от токсинов, описанных в предыдущем разделе. Они были найдены у почвенных бактерий Bacillus brevis [14, 15]. Из указанных бактерий они экстрагируются этиловым спиртом, но не водой. При добавлении к спиртовому экстракту эфира происходит осаждение токсина, получившего название тироцидина; второй токсин, названный грамицидином, остается в растворе. Грамицидин и тироцидин являются пептидами, имеющими своеобразное строение; они лишены как свободных аминогрупп, так и свободных карбоксильных групп и, по всей вероятности, представляют собой циклопептиды [16]. В отличие от других природных пептидов и белков грамицидин и тироцидин содержат d-аминокислоты [18], а также орнитин и этаноламин [18].

Наиболее простым из этих циклопептидов является грамицидин С [19]. Он представляет собой l-валил-l-орнитил-l-лейцил- d-фенилаланил-l-пролилциклопептид [18, 20]¹.

Молекула грамицидина, полученного из В. brevis, имеет следующий состав: d-лей₆, l-три₆, d,l-вaл4, l-ала₄, гли₂; кроме того, пептид содержит 2 молекулы этаноламина [18]. Методом противоточного распределения было установлено, что грамицидин вопреки первоначальному мнению не является однородным веществом, а представляет собой смесь нескольких пептидов [21, 22]. Тироцидин имеет следующий состав: фен₃, глу₂, асп₂, орн₂, три₂, про₂, лей₂, вал₂, аммиак₃ [15]. Грамицидин обладает необычайно сильной токсичностью по отношению к грамположительным бактериям, тироцидин же действует как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии. Хотя оба препарата обладают бактериостатическим действием, они не могут быть использованы для терапевтических целей вследствие их токсичности для человека². Сходные антибиотические полипептиды были выделены и из других бактерий [22]. Один из них, аэроспорин (полимиксин А), интересен тем, что в его состав входит а, у-диаминомасляная кислота [23].

Эндотоксины. Бактериальные эндотоксины были найдены у Eberthella typhosa, Vibrio cholerne и в различных типах Salmonella dysenteriae. Эндотоксины экстрагируются из бактерий при помощи трихлоруксусной кислоты или диэтиленгликоля. В отличие от многих белков они устойчивы к действию трипсина [25] и не разрушаются при нагревании.

Эндотоксины представляют собой комплексы, образованные углеводом, фосфолипидом и белком или пептидом; они присутствуют в гладких S-формах бактерий и отсутствуют в R-формах [25]. Кроме О-антигена, в жгутиках бактерий был найден так называемый Н-антиген [26]. Эндотоксин дизентерийных бактерий типа Shiga можно экстрагировать диэтиленгликолем. Этот эндотоксин расщепляется на свои компоненты при обработке 90-процентным фенолом [27]. Серологическая специфичность этого эндотоксина определяется углеводным компонентом, который представляет собой гаптен (см. гл. XIV), приобретающий антигенные свойства при соединении с белком [27]. Подобный же эндотоксин был выделен из дизентерийной бактерии типа Flexner [28].

¹ Относительно строения грамицидина С см. примечание на стр. 43. — Прим. ред.

² Утверждение автора, что грамицидин вследствие своей токсичности не может применяться для терапевтических целей, неверно. В хирургической практике грамицидин получил широкое применение при лечении ран, причем в связи с медленным всасыванием его токсическое действие почти не проявляется. Токсичность грамицидина препятствует только его внутривенному или подкожному введению. — Прим. ред.Эндотоксины были выделены также из Brucella melitensis [29] и из Eberthella typhosa [30]. Последний эндотоксин, очищенный при помощи фракционирования ацетоном, содержит 50—60% углеводов, 3—4% липидов и около 30% пептидоподобного вещества [30].

Туберкулин, полученный из туберкулезных бацилл, также является белковым производным. При фракционировании туберкулина этиловым спиртом и по методу электрофореза были выделены два полисахарида, три белка (А, В и С) и циклопептид (D). Типичная кожная реакция в ответ на введение в кожу туберкулина вызывается белком А [31, 32]. Интересно отметить, что белки туберкулезных бацилл токсичны только для зараженного организма и безвредны для нормального [33].