Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Электрохимия белков
Соединение белков с другими ионами

В предыдущем разделе было указано (см. также стр. 221), что белки соединяются не только с ионами водорода, но также и с другими ионами, присутствующими в растворе, и что это явление оказывает влияние на электрометрическое титрование и определение изоэлектрической точки белков. Соединение белка с другими ионами обусловлено электростатическими силами ионизированных групп: анионы связываются с положительно заряженными группами белка, в то время как катионы притягиваются отрицательно заряженными группами Связывание посторонних ионов белковыми молекулами имеет огромное биологическое значение, так как часть неорганических ионов, присутствующих в тканевых жидкостях, связана именно таким образом.

Наличие ионно-белковых комплексов в тканевых жидкостях может быть установлено путем их диализа против безбелкового раствора, содержащего тот же ион в той же концентрации [39]. Если этот ион в тканевой жидкости находится в несвязанном состоянии, то никакого изменения в его концентрации не будет наблюдаться. В том же случае, когда часть ионов связана белком, ионы будут переходить из диализата в тканевую жидкость до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие между свободными ионами по обе стороны мембраны.

Связь неорганических ионов с белковыми молекулами обнаруживается также в электрофоретических опытах. В этих опытах часто наблюдается перемещение катионов, например Са⁺⁺, к аноду или анионов к катоду, на основании чего можно заключить, что ион связан молекулой белка и образованный ими комплекс движется как единое целое.

Связывание белками различных ионов зависит главным образом от валентности последних. Одновалентные ионы щелочных металлов и ион хлора связаны лишь в ничтожной степени, и основная масса их в тканевых жидкостях находится в свободном состоянии. Ионы же кальция, магния и фосфата в тканевых жидкостях, наоборот, в значительной своей части связаны с белками.

Тот факт, что белки осаждаются солями тяжелых металлов, также указывает на то, что ионы этих металлов образуют многочисленные прочные связи с белками. Связывание неорганических и органических ионов белками происходит не только в жидкостях организма, но также in vitro, когда пользуются буферными растворами. Чтобы избежать соединения ионов с белками, необходимо употреблять в качестве буферов растворы солей с одновалентными ионами, например соли уксусной, диэтилбарбитуровой или одноосновной фталиевой кислот со щелочными металлами.

Из числа ионов, образующих соединения с белками, кальций изучался особенно тщательно. Около 40% кальция в мышечной сыворотке [40] и приблизительно 1/3 кальция сыворотки крови связаны белковыми молекулами [41]. Один грамм белков сыворотки способен присоединить 0,062 мМ кальция [42]. Соединение белков с Са⁺⁺ происходит согласно закону действия масс [43]. В молоке значительная часть кальция связана с фосфорнокислыми группами казеина [44]. Магний в физико-химическом отношении ведет себя подобно кальцию, и в мышечной сыворотке и в сыворотке плазмы значительные количества ионов магния связаны молекулами белка [40, 41].

В физико-химическом равновесии сыворотки крови соединение фосфата с белковыми молекулами имеет ничтожное значение, поскольку содержание фосфата в сыворотке очень низко.

Большое значение имеет соединение углекислоты с белками. Зигфридом [46] было показано, что аминокислоты соединяются с карбонатами, образуя каpбаминокислоты

Реакция происходит только в щелочных растворах. Полагают, что таким же образом часть углекислоты, присутствующей в крови, соединяется с белковым компонентом гемоглобина, образуя карбгемоглобин [47—52]. Это предположение опирается на тот факт, что кровь соединяется с двуокисью углерода в две фазы; вторая, более медленная фаза отвечает хорошо известному медленному превращению двуокиси углерода в бикарбонат. Этой фазе предшествует быстрый захват двуокиси углерода, который связывают с образованием карбаминосоединения. Действительно, было установлено, что часть углекислоты не может быть осаждена гидроокисью бария.

Следует помнить, однако, что образование типичного карбамата имеет место только в сильно щелочных растворах, когда аммонийная группа N⁺H₃ превращена в аминогруппу NH₂; неясно поэтому, могут ли карбаминосоединения образовываться в заметных количествах при физиологических условиях. Следует также принимать во внимание, что ионы бикарбоната могут реагировать с положительно заряженными группами белка по формуле

Это наблюдается в подвергнутых электродиализу бессолевых растворах белка [20, 53]. Соединение двуокиси углерода с гемоглобином имеет большое значение в физико-химическом равновесии крови, поскольку в присутствии углекислоты сродство гемоглобина к кислороду снижается — явление, хорошо известное в физиологии. Влияние углекислоты на сродство гемоглобина к кислороду обусловлено тем, что двуокись углерода соединяется с основными аминогруппами или имидазольными группами, расположенными в непосредственной близости к атому железа, к которому присоединяется кислород [52, 54].

Электрометрическое титрование и определение электропроводности белковых растворов в присутствии хлористых солей щелочных металлов показало, что небольшие количества этих одновалентных ионов также связываются с белками [27, 55, 56]. В сыворотке крови - это количество, однако, настолько мало, что оно не может быть определено ни компенсационным диализом [39], ни электрофоретическим измерением чисел переноса [57]. Данные же электрометрического титрования и определений электропроводности показали, что около 10 функциональных групп молекулы сывороточного альбумина довольно прочно соединяются с анионами хлористых или роданистых солей и что, кроме того, значительное количество этих анионов связано с белком более слабыми связями [27]. Максимальное число ионов, связанных белком, хорошо совпадает с числом групп противоположного знака, находящихся в белковой молекуле. Так, например, было установлено, что яичный альбумин соединяется с метафосфорной кислотой, образуя кристаллическое соединение, в котором содержится приблизительно по одной молекуле метафосфорной кислоты на каждую положительно заряженную группу белка [58].

Из соединений белков с тяжелыми металлами заслуживают упоминания природные соединения белка с медью, например гемокупреин из эритроцитов крови быка [59], гепатокупреин из печени [59], гемоцианины крови некоторых видов беспозвоночных (см. гл. XI) и содержащие медь оксидазы [60]. Медь содержится не только в растворимых белках печени, но также и в нерастворимом остатке, который получают после экстракции разбавленным аммиаком [61]. По-видимому, во всех этих соединениях ионы меди связаны с отрицательно заряженными группами белка. Подобным же образом соединяются белки с медью и in vitro. Связывание меди сывороточным альбумином сопровождается освобождением свободной энергии; ∆F снижается от —5 179 кал на 1 экв при присоединении первого иона меди до —1 271 кал при связывании шестнадцатого иона меди. Одновременный прирост энтропии указывает, что молекулы гидратационной воды вытесняются ионами меди и их связь с белком разрывается [62].