Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Взаимодействие белков с водой
Гидратация растворенных белков

Попытки исследовать гидратацию растворенных белков были предприняты еще до того, как было изучено поведение при гидратации сухих белков. При этих исследованиях предполагалось, что часть воды в белковых растворах находится в свободном состоянии, остальная же часть — присоединена к белку. Для определения количества свободной и связанной с белком воды применяются различные методы. Один из них основан на измерении увеличения объема, которое наблюдается при замерзании раствора. Поскольку плотность льда значительно ниже, чем плотность воды, замерзание свободной воды сопровождается отчетливым увеличением объема, которое может быть измерено при помощи дилатометра. Этим методом было обнаружено, что определенная часть воды в белковых растворах не замерзает [21]. Было высказано предположение, что именно эта часть воды и представляет собой гидратную воду. Известно, однако, что вода легкo может быть охлаждена ниже точки замерзания, не превращаясь в лед. Это обстоятельство послужило основанием для возражений, выдвинутых против применения указанного метода, так как неясно, является ли незамерзшая вода действительно гидратной или просто переохлажденной водой.

Высказывалось также предположение, что часть гидратной воды белков присутствует в виде «льда», который, как хорошо известно, занимает большее пространство, чем незамерзшая вода. Возможно, что значительное уменьшение начального объема при ферментативном гидролизе белков происходит за счет перехода молекул льда в молекулы воды (см. гл. XVI) [22].

Другой метод, применяемый для той же дели, основан на определении растворимости мочевины, глюкозы и других неэлектролитов в растворах белков. Было высказано предположение, что гидратная вода, связанная с белками, неспособна функционировать как растворитель для других веществ. Растворимость добавленных неэлектролитов можно определить путем химического анализа при помощи криоскопии или измерением упругости пара. Однако этот метод не растворяющего объема имеет ряд серьезных недостатков. Один из них обусловлен тем, что в систему вводится постороннее вещество, которое может конкурировать с белком за воду и поэтому может уменьшать начальную степень гидратации. Другой зависит от нашего неуменья отличать адсорбцию ионов Н⁺ и ОН^- от действительной гидратации, т. е. от присоединения молекул воды к белку [23]. Однако самый серьезный недостаток указанного метода связан с тем, что добавленные к раствору белка вещества сами иногда присоединяются к белку, в связи с чем вместо ожидаемого уменьшения растворимости имеет место увеличение последней [24]. Несмотря на эти недочеты, описанный метод позволил все же получить ряд ценных результатов. В сравнительных опытах, проведенных при различных значениях pH и при различных температурах, было найдено, что нерастворяющий объем почти не зависит от pH [25]. Из этих данных следует, что высокая вязкость щелочных растворов белков не может быть приписана увеличению гидратации, как это делали раньше. Другим важным результатом этих исследований было установление того факта, что нерастворяющий объем лишь незначительно уменьшается при денатурации и тепловой коагуляции белка [26]. Оказалось, что коагулированные белки обладают способностью связывать воду почти в той же мере, как и нативные растворенные белки.

В связи с тем что явление гидратации сопровождается уменьшением объема, о степени гидратации можно судить, определяя плотность сухих белков и белковых растворов одним из способов, описанных в начале этой главы. Уменьшение объема, сопровождающее гидратацию белков, может достигать 5—8 мл на 100 г сухого белка [27].

В одном из подобных опытов было найдено, что плотность сухого яичного альбумина, взвешенного в бензоле, равна 1,2715, а кажущаяся плотность его в воде равна 1,377. Увеличение плотности соответствует уменьшению удельного объема с 0,786 мл на 1 г сухого белка до кажущегося объема, равного 0,726 мл на 1 г сухого белка [28].

Плотность большинства сухих белков близка к 1,27, а кажущаяся плотность белков в растворе — к 1,34. Если графически изобразить зависимость плотности раствора от концентрации растворенного в нем белка, то получится прямая линия. Величина I — (d_H—d_A)/C_б, обозначает приращение плотности; d_н — плотность недиализированного белкового раствора, d_Д — плотность диализированного белкового раствора и с_б — концентрация белка в граммах на 1 мл. Приращение плотности почти не зависит ни от концентрации белка, ни от pH, но зависит от концентрации солей в растворе [1]. Для карбоксигемоглобина приращение I плотности равно 0,251 в воде и 0,21 в 1-процентном растворе хлористого натрия.

Дж. Адэр и М. Адэр [1, 29] определили количество воды, связанной белком в растворе. Эти авторы измерили плотность белковых растворов, находившихся в равновесии с соответствующими диализатами. Если приращение плотности белка в растворах, содержащих различные количества буфера, обозначить через I₁ и I₂, а плотности белков в диализатах через d₁ и d₂, то нерастворяющий объем будет равен V_нр = (І₁— І₂)/(d₂ — d₁). Нерастворяющий объем складывается из объема, занимаемого связанной водой, и кажущегося удельного объема белка, т. е. объема, занимаемого растворенными гидратированными частицами белка в 1 мл раствора. Количество связанной воды можно определить вычитанием кажущегося удельного объема из величины нерастворяющего объема.

Растворенный сывороточный альбумин связывает приблизительно 40 г воды на 100 г сухого белка [1]. Эта цифра близка к максимальному количеству воды, которое может присоединить 1 г сухого белка (см. фиг. 24). Сходные результаты были получены с другими белками [30]. Количество связанной воды варьирует от 20 до 50 г на 100 г белка. Удивительно низкое содержание воды (15%) было найдено у вируса табачной мозаики.

Приведенные выше данные показывают, что при гидратации белковых кристаллов и растворенных белков наибольшее сокращение объема наблюдается в области низкого давления водяного пара (см. фиг. 24). Кажущийся удельный объем белков в белковых кристаллах вряд ли отличается от кажущегося удельного объема белков в растворе. Обе эти величины, однако, значительно ниже величин удельного объема сухих белков.