Химия и биология белков - Ф. Гауровитц 1953

Белки с ферментативными свойствами
Физико-химические свойства ферментов

Некоторые ферменты, находящиеся в растворенном виде в желудочном и кишечном соке, в сыворотке крови и в других жидкостях тела, представляют собой типичные глобулины, растворимые в разведенных растворах нейтральных солей. Подобные же ферменты, находящиеся в клетках, могут быть экстрагированы при помощи тех же методов, какими экстрагируются другие растворимые клеточные белки. При кратковременном скоростном центрифугировании можно удалить из этих мутных экстрактов митохондрии или другие клеточные гранулы, содержащие некоторые ферменты. Другие ферменты содержатся в микросомах, которые оседают из экстрактов только после продолжительного центрифугирования при высоких скоростях. Часть ферментов, наконец, находится во фракции нерастворимых структурных клеточных белков. В то время как большинство гидролитических ферментов, таких, например, как пепсин, трипсин или уреаза, представляют собой растворимые белки глобулярного типа, окислительные ферменты — сукциноксидаза и цитохромоксидаза — находятся главным образом в клеточных гранулах [12]. Расщепление АТФ миозином говорит о том, что ферментативную активность могут проявлять также фибриллярные белки [13].

Коллоидальное (нерастворимое) состояние ферментов в клетках имеет, повидимому, существенное значение для проявления их действия. Если бы каталитически активные низкомолекулярные простетические группы находились в клетке в свободном виде, то они могли бы диффундировать через клеточные мембраны и таким путем уходить из клеток. Эта потеря предотвращается присоединением небольших молекул, например молекул гема или рибофлавина, к молекулам белка.

Другим следствием коллоидального состояния ферментов является образование поверхностей раздела между водной фазой и нерастворимой (коллоидальной) белковой фазой. Гетерогенный характер среды, в которой находятся ферменты, во многих случаях способствуют проявлению их действия. Так, например, гемин, который обладает сильно выраженным липооксидазным действием в гетерогенной среде (эмульсия вода — масло), совершенно теряет активность в указанном отношении при переводе эмульсии в гомогенный раствор путем добавления этилового спирта или желчных солей [14].

Все ферменты можно разделить на два типа: на ферменты, не имеющие простетических групп, и на ферменты, имеющие каталитически активные небелковые группы (например, гем, рибофлавин, медь или тиаминпирофосфат). Как правило, ферменты, участвующие в окислительно-восстановительных реакциях, принадлежат ко второму типу, тогда как гидролитические ферменты не содержат, повидимому, простетических групп. Впрочем, в отношении последнего заключения необходимо быть очень осторожным. Хотя аминокислотный анализ этих ферментов показал, что они состоят, по крайней мере, на 99% из аминокислот, однако это еще не дает права с категоричностью утверждать, что данные ферменты не имеют того или иного рода простетической группы. Если молекулярный вес молекулы фермента равен 50 000, то 1 % составляет 500, а это означает, что в молекуле фермента может содержаться какая-то до сих пор еще неизвестная простетическая группа. Исследования над пептидазами, повидимому, подтверждают то мнение, что даже очень чистые препараты однокомпонентных ферментов содержат простетическую группу. Эти исследования показали, что активность некоторых пептидаз зависит от наличия в их составе ионов металлов [15], таких, как кобальт, цинк, марганец, магний или кальций. Так, например, было установлено, что карбоксипептидаза [16] и щелочная фосфатаза из почки [17] представляют собой соединение белка с магнием.

По предложению некоторых исследователей, белковая часть фермента была названа апоферментом, а простетической группе было присвоено название кофермент. Кофермент в большинстве случаев можно отделить от апофермента, например, путем диализа против кислоты. Апоферменты, подобно прочим белкам, денатурируются при нагревании. В настоящее время можно считать установленным, что апоферменты, отделенные от коферментов, менее устойчивы по отношению к действию денатурирующих агентов, чем молекула фермента в целом. На этом основании можно сделать заключение, что кофермент, соединяясь с апоферментом, стабилизирует последний. Коферменты в свободном состоянии являются термостабильными веществами и при кипячении в растворе не теряют своих свойств, в связи с чем при соединении кофермента с апоферментом восстанавливается присущая целой молекуле фермента активность.

Хотя у сложных ферментов действующей группой является, несомненно, кофермент, для проявления полной активности фермента наличие апофермента совершенно обязательно. Изолированная простетическая группа, как правило, обладает лишь очень слабой каталитической активностью. При соединении простетической группы с апоферментом каталитическая активность возрастает иногда более чем в 1 000 раз по сравнению с активностью свободной простетической группы. Это обусловлено отчасти большим молекулярным весом образовавшегося комплекса, отчасти же специфическим действием апофермента, который не может быть заменен никаким другим белком. Все апоферменты обладают специфичностью, выражающейся в том, что они могут соединяться только с определенными коферментами, причем кофермент после соединения с апоферментом может катализировать только определенные специфические реакции.

¹ В работе, опубликованной в 1951 г. (Биохимия, 16, 81, 1951), С. М. Бреслер и Н. А. Розенцвейг приходят к заключению, что трипсин и химотрипсин содержат в составе своего активного комплекса ионы металлов: химотрипсин— магний, а трипсин—хром. Согласно данным этих авторов, магний в химотрипсине прочно связан и не отщепляется при диализе, хром же трипсина связан непрочно и может отщепляться при диализе, а также замещаться на магний; каталитическая активность трипсина при этом сохраняется. — Прим. ред.

В то время как апоферменты могут соединяться только с одним каким-нибудь определенным коферментом, один и тот же кофермент обладает способностью соединяться с различными апоферментами. Так, например, такие резко отличающиеся по каталитическим свойствам вещества, как гемоглобин, каталаза, псроксидаза и дитохром с, содержат в качестве простетической группы один и тот же протогем и отличаются друг от друга лишь белковыми компонентами. Сходным образом некоторые дегидразы, например дегидраза молочной кислоты и дегидраза фосфоглицеринового альдегида, имеют одну и ту же простетическую группу — пиридиннуклеотид, но различные апоферменты [18].

Характер связи между коферментом и апоферментом может быть различным. Так, в некоторых ферментах кофермент связан с апоферментом посредством ковалентных связей, в других — при помощи электровалентных связей или сил Ван-дер-Ваальса. Мы еще не можем удовлетворительно объяснить, чем определяется характер этих связей и каким образом апофермент обусловливает специфичность действия простетической группы.