БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015
МОДУЛЬ II
ФЕРМЕНТИ ТА МЕТАБОЛІЧНІ ШЛЯХИ.
Лабораторна робота 8
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ПІДТВЕРДЖЕННЯ ФУНКЦІОНУВАННЯ ЦИКЛУ ТРИКАРБОНОВИХ КИСЛОТ
Мета роботи: засвоїти метод експериментального підтвердження функціонування циклу трикарбонових кислот за утворенням СО2.
Основні теоретичні відомості
Цикл трикарбонових кислот (ЦТК) — основний метаболічний шлях енергетичного обміну. Субстратом ЦТК є ацетил-КоА, який утворюється переважно в реакціях β-окислення вищих жирних кислот або в реакціях окисного декарбоксилювання пірувату.
Реакції ЦТК циклічні, інтермедіати можуть бути використані не тільки в реакціях катаболізму, але й в анаболічних (наприклад для синтезу амінокислот, глюкози). Тому ЦТК є амфіболічним процесом.
У ЦТК є чотири дегідрогеназні реакції, у яких відновлюються коферменти, що у свою чергу є субстратами дихального ланцюга, а також дві декарбоксилазні реакції, у яких виділяється по одній молекулі СО2. Виділення газу є одним з доказів функціонування ЦТК.
Обладнання: пробірки, піпетки, фарфорова ступка з товкачиком, скляний пісок, вата, лійка, рН-метр, термостат, ваги, газовий пальник.
8.1. Підтвердження функціонування циклу трикарбонових кислот мітохондрій за утворенням СО2
Матеріали та реактиви: ферментний препарат, що містить ферменти ЦТК та окисного декарбоксилювання пірувату (5 г пивних дріжджів розтирають у фарфоровій ступці з 2—3 мл дистильованої води та невеликою кількістю скляного піску, додають 8—10 мл води та фільтрують через вату), фосфатний буфер 1/15 М, рН = 7,4; піровиноградна кислота або піруват натрію 5 %-й, суспензія Са(ОН)2, 0,1 М розчин H2SО4.
Порядок виконання роботи
Перетворення ацетил-S-KoA за наявності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується утворенням СО2. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту, яка під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилюванню з утворенням ацетил-S-KoA.
Дві пробірки — контрольну та дослідну — заповнюють реактивами за табл.8.1.
Для зв’язування СО2, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)2. Після закінчення інкубації зв’язаний СО2 визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сірчаної кислоти.
Таблиця 8.1
Вміст контрольної та дослідної пробірок
Вміст пробірок, мл |
Пробірки |
|
контрольна |
дослідна |
|
Фосфатний буфер, рН = 7,4 |
2,0 |
2,0 |
Розчин пірувату натрію |
0,5 |
0,5 |
Суспензія Са(ОН)2 |
0,5 |
0,5 |
Ферментний препарат |
— |
0,5 |
Ферментний препарат після кип’ятіння |
0,5 |
— |
Інкубація в термостаті 15 хв за температури 37 °С |
||
0,1 М розчин H2SО4 |
1,0 |
1,0 |
Результати: виділення СО2 |
||
Оброблення експериментальних даних
Напишіть всі реакції ЦТК, позначте інтермедіати ЦТК, ферменти, субстрати та продукти реакцій. Побудуйте таблицю, у якій укажіть, до якого класу ферментів належить кожен з ферментів ЦТК. Виведіть сумарне рівняння ЦТК. Випишіть декарбоксилазні, дегідрогеназні реакції, назвіть піридинзалежні та флавінзалежні дегідрогенази. Напишіть структуру коферментів дегідрогеназних реакцій в окисненій та відновленій формах. Побудуйте таблицю, у якій укажіть джерело кожного з восьми атомів водню, що приєднались до коферментів при їх відновленні в реакціях ЦТК.
Контрольні запитання та завдання
1. Яка внутрішньоклітинна локалізація ферментів ЦТК?
2. Поясніть будову та функції мітохондрій.
3. Чому в роботі необхідно зв’язувати СО2, а потім вивільняти його під час взаємодії із сульфатною кислотою? Напишіть рівняння відповідних реакцій.
4. Які конкурентні інгібітори сукцинатдегідрогенази ви знаєте? Як позбавитись впливу конкурентного інгібітора?
5. Наведіть визначення лімітуючої реакції метаболічного процесу. Назвіть лімітуючу реакцію ЦТК.
6. Доведіть, що ЦТК є амфіболічним процесом.
7. Які реакції називаються анаплеротичними? Які реакції є анаплеротичними реакціями ЦТК?
8. Які вітаміни необхідні для функціонування ЦТК?
9. Поясніть функціонування α-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу. Які ферменти та коферменти він містить?