Основы биохимии Том 1 - А. Ленинджер 1985

Биомолекулы
Ферменты
Существует количественная связь между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции

На рис. 9-4 показана кривая, характеризующая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Из рисунка видно, что но этой кривой, которая только приближается к точке, соответствующей максимальной скорости реакции, но никогда ее не достигнет, трудно определить точно, при какой концентрации субстрата устанавливается V_mах. Однако благодаря тому, что эта кривая, представляющая собой гиперболу, имеет одинаковую форму для большинства ферментов, Михаэлис и Ментен определили константу, обозначаемую в настоящее время через К_M, при помощи которой удобно выражать точное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью катализируемой ферментом реакции. Величину К_M, иначе константу Михаэлиса-Ментен. можно определить просто как концентрацию специфического субстрата, при которой

данный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине ее максимальной скорости (рис. 9-4).

Характерная форма кривой насыщения фермента субстратом (рис. 9-4) может быть выражена математически уравнением Михаэлиса Ментен

где v₀ начальная скорость при концентрации субстрата [S], V_max - максимальная скорость и К_M - константа Михаэлиса-Ментен для данного фермента, соответствующая определенному субстрату.

Это уравнение было выведено Михаэлисом и Ментен исходя из основного предположения о том. что стадией, лимитирующей скорость ферментативных реакций, является распад комплекса ES на продукт и свободный фермент. В дополнении 9-1 представлен современный вариант вывода уравнения Михаэлиса-Ментен. Это уравнение составляет основу для анализа кинетики всех ферментативных реакций. Если известны величины К_М и V_mах то можно рассчитать скорость ферментативной реакции при любой заданной концентрации субстрата.

Дополнение 9-1. Уравнение Михаэлиса-Ментен

Для многих ферментов характерна гиперболическая кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 9-4), постепенно приближающаяся к точке, соответствующей насыщению фермента субстратом. Мы уже видели, что такие кривые имеют две основные точки: 1) К_M - концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине ее максимальной скорости, и 2) V_mах — максимальная скорость, т. е. предельное значение, к которому приближается скорость реакции при бесконечно большой концентрации субстрата. Михаэлис и Ментен показали, что из гиперболических кривых насыщения ферментов можно извлечь много дополнительной полезной информации, если перевести их в простую математическую форму. Уравнение Михаэлиса-Ментен представляет собой алгебраическое выражение гиперболической формы таких кривых. Членами этого важнейшего уравнения являются: концентрация субстрата S, начальная скорость v₀, V_mах и К_M. Уравнение Михаэлиса-Ментен лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитывать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования.

Теперь мы рассмотрим подробнее основные логические и алгебраические этапы, через которые проходит вывод уравнения Михаэлиса-Ментен на современном уровне. Прежде всего напишем две основные реакции образования и распада фермент-субстратного комплекса

Введем следующие обозначения: [E_t] - общая концентрация фермента (суммарное количество свободного и связанного фермента), [ES] - концентрация фермент-субстратного комплекса и [E_t] — [ES] - концентрация свободного, т. е. несвязанного, фермента. Поскольку концентрация субстрата [S] обычно гораздо больше, чем [E_t], количество субстрата S, связанного с ферментом Е в любой момент времени, можно считать пренебрежимо малым по сравнению с общим количеством субстрата S. Вывод уравнения начинается с определения скоростей образования и распада фермент-субстратного комплекса ES.

1. Скорость образования ES. Скорость образования ES в реакции (а) равна

Скорость образования = k₁([E_t] — [ES]) [S] (в)

где k₁ - константа скорости реакции (а). Скорость образования ES из Е + Р в обратной реакции (б) очень мала по сравнению со скоростью прямой реакции и поэтому ею можно пренебречь.

2. Скорость распада ES. Скорость распада ES равна

Скорость распада = k_-1, [ES] + k₂ [ES], где k_-1 и k_{2 -} константы скорости соответственно обратной реакции (а) и прямой реакции (б).

3. Стационарное состояние. Когда скорость образования фермент- субстратного комплекса ES равна скорости его распада, концентрация ES постоянна, и реакция протекает в стационарном режиме:

Скорость образования ES = Скорость распада ES

k₁ ([E_t] - [ES]) [S] = k_-1 [ES] + k₂ [ES] (г)

4. Разделение констант скоростей. Преобразование левой части уравнения (г) дает

k₁ [E_t] [S] - k₁ [ES] [S]

При упрощении его правой части получаем (k_-1 + k₂) [ES]. Следовательно,

k₁ [E_t] [S] - k₁ [ES] [S] = (k_-1 + k₂) [ES].

Если перенести член — k₁ [ES] [S] в правую часть уравнения и изменить его знак, то получим

k₁ [E] [S] = k₁ [ES] [S] + (k_-1 + k₂) [ES] .

Дальнейшее упрощение дает

k₁ [E_t] [S] = (k₁[S] + k_-1 + k₂) [ES].

Теперь мы можем решить это уравнение относительно [ES]

Это уравнение можно упростить, объединив константы скоростей в одном уравнении:

5. Определение начальной скорости v₀ через [ES]. Согласно теории Михаэлиса-Ментен, начальная скорость определяется как скорость распада фермент-субстратного комплекса, т. е. скорость реакции (б), константа скорости которой равна k₂. Таким образом, мы можем написать

v₀ = k₂ [ES] .

Поскольку, однако, величина [ES] равна правой части уравнения (д), мы имеем:

Полученное уравнение можно упростить, если (k₂ + k_-1)/k₁ обозначить через К_M (константа Михаэлиса-Ментен), a k₂ [E_t] - через V_mах∙ V_mах - это максимальная скорость реакции, наблюдаемая в условиях, когда весь фермент Е находится в форме фермент-субстратного комплекса ES. Подставив эти две величины в уравнение (е), получим:

Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен, т. е. уравнение скорости односубстратной ферментативной реакции. Оно выражает количественное соотношение между начальной скоростью реакции v₀, максимальной скоростью реакции V_max и исходной концентрацией субстрата, связанных между собой через константу Михаэлиса-Ментен К_M. В специальном случае, когда начальная скорость реакции в точности равна половине максимальной скорости, т.е. когда (рис. 9-4), можно, исходя из уравнения Михаэлиса-Ментен, получить важное численное соотношение:

Если разделить обе части этого уравнения на V_mах, то будем иметь

Решая это уравнение относительно К_M, получаем:

Уравнение Михаэлиса-Ментен можно преобразовать алгебраическим способом и выразить в виде ряда эквивалентных уравнений, которые полезны для практического определения величин К_M и V_mах и используются также при изучении действия ингибиторов (дополнение 9-2).

Теория Михаэлиса-Ментен позволяет количественно описать большинство ферментативных реакций, включая реакции с участием двух или более субстратов. Это служит еще одним убедительным подтверждением того, что ферменты катализируют реакции, временно присоединяясь к своим субстратам, в результате чего снижается энергия активации всей реакции в целом. Образование фермент-субстратных комплексов можно доказать с помощью прямых физико-химических методов, например по характерным изменениям спектр а поглощения фермента при добавлении субстрата.

Дополнение 9-2. Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен: график в двойных обратных координатах

Уравнение Михаэлиса-Ментен

можно преобразовать алгебраическим способом в другие формы, более удобные для анализа экспериментальных данных. Одно часто применяемое преобразование состоит просто в том, что обе части уравнения Михаэлиса-Ментен (а) выражают в виде обратных величин

Разделив числитель в правой части уравнения на его составляющие, получаем

Упрощение этого уравнения дает

Уравнение (б), представляющее собой преобразованное уравнение Михаэлиса - Ментен, называется уравнением Лайнуивера-Бэрка. Для ферментов, строго подчиняющихся кинетике Михаэлиса-Ментен, зависямость 1 /v₀от 1 [S] выражается прямой линией (рис. 1). Тангенс угла наклона этой линии численно равен величине К_M/V_max, отрезок, отсекаемый на оси ординат, - величине 1/V_max, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс,-1/К_M. График, построенный в двойных обратных координатах (график Лайнуивера-Бэрка) имеет то преимущество, что позволяет более точно определить величину V_max, которая на графике зависимости v₀ от [S] может быть лишь аппроксимирована (как показано на рис. 2). Существуют и другие способы преобразования уравнения Михаэлиса - Ментен. Каждый из них имеет свои преимущества при исследовании кинетики ферментативных реакций.

Как мы увидим дальше, графики в двойных обратных координатах с большой пользой применяются также при изучении ингибирования ферментативных реакций.