Основы биохимии Том 2 - А. Ленинджер 1985

Биоэнергетика и метаболизм
Цикл лимонной кислоты
Краткое содержание главы

Клеточное дыхание включает три стадии: 1) окислительное образование ацетил-СоА из пирувата, жирных кислот и аминокислот, 2) расщепление ацетильных остатков в цикле лимонной кислоты, в результате которого образуются СО₂ и атомы водорода, и 3) перенос электронов на молекулярный кислород, сопряженный с окислительным фосфорилированием ADP до АТР. При окислительном катаболизме глюкозы выделяется гораздо больше энергии, чем при анаэробном гликолизе. В аэробных условиях конечный продукт гликолиза прируват подвергается сначала дегидрированию и декарбоксилированию с образованием ацетил-СоА и СО₂. Катализирует этот процесс пируватдегидрогеназный комплекс, состоящий из трех последовательно действующих ферментов. Цикл лимонной кислоты протекает в митохондриях. Он начинается реакцией, в которой цитрат-синтаза катализирует конденсацию ацетил-СоА и оксалоацетата, в результате чего образуется цитрат. В присутствии аконитазы цитрат в обратимой реакции превращается в изоцитрат, который затем дегидрируется с образованием а-кетоглутарата и СО₂ с помощью NAD- и NADP-зависимых изоцитратдегидрогеназ. В результате дегидрирования и декарбоксилирования а-кетоглутарата образуются сукцинил-СоА и СО₂. Сукцинил-СоА взаимодействует при участии сукцинил-СоА - синтетазы с GDP и фосфатом, в результате чего образуется свободный сукцинат, а также GTP, который затем передает свою концевую фосфатную группу на ADP. Сукцинат окисляется до фумарата под действием одного из флавинсодержащих ферментов - сукцинатдегидрогеназы. Фумарат обратимо гидратируется фумаразой с образованием L-малата. который затем окисляется NAD-зависимой L-малатдегидрогеназой. В результате окисления малата регенерирует одна молекула оксалоацетата. Эта молекула может теперь соединиться с новой молекулой ацетил-СоА и тем самым начать новый оборот цикла. Опыты с изотопной меткой, в которых изотопами углерода были помечены молекулы «топлива» или промежуточные продукты, убедительно доказали, что цикл лимонной кислоты представляет собой главный путь окисления углеводов в животных клетках. Общая скорость функционирования цикла в печени определяется скоростью превращения пирувата в ацетил-СоА, а также скоростью реакции, в ходе которой из ацетил-СоА образуется цитрат. Эта реакция катализируется цитрат-синтазой, аллостерическим ферментом, на который оказывают ингибирующее действие сукцинил-СоА и некоторые другие вещества, играющие роль отрицательных модуляторов.

Промежуточные продукты цикла лимонной кислоты используются также в качестве предшественников при биосинтезе аминокислот и других биомолекул. Их убыль восполняется благодаря анаплеротическим реакциям. Среди этих реакций главную роль играет сопровождающаяся расходованием АТР реакция карбоксилирования пирувата, в результате которой образуется оксалоацетат. В растениях и некоторых микроорганизмах, для которых единственным источником углерода при синтезе углеводов служит ацетат, действует глиоксилатный цикл, представляющий собой модификацию цикла лимонной кислоты. Этот путь обеспечивает образование из ацетил-СоА сукцината и некоторых других промежуточных продуктов для нужд биосинтеза.

Глюкоза может вступать во вторичные катаболические реакции, в результате которых образуются специальные продукты. Пентозофосфатный путь, начинающийся с дегидрирования глюкозо-6-фосфата, поставляет рибозо-5-фосфат и NADPH. Реакции пентозофосфатного пути, приводящие к этим продуктам, протекают в растворимой части цитоплазмы - цитозоле. Рибозофосфаты служат предшественниками при синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот, a NADPH используется в качестве главного восстановителя при биосинтезе таких богатых водородом соединений, как жирные кислоты и холестерол. Из глюкозы образуется и UDP-D-глюкуронат, который способствует обезвреживанию некоторых чужеродных веществ в организме, а также является предшественником L-аскорбиновой кислоты (витамина С).

ЛИТЕРАТУРА

Книги

Goodwin Т. W. (ed.). The Metabolic Roles of Citrate, Academic, New York, 1968. Симпозиум в честь сэра Ганса Кребса.

Lehninger A. L. Biochemistry, 2d ed., Worth, New York, 1975. (Имеется перевод: Ленинджер А. Биохимия-M.: Мир, 1976.) В гл. 17 содержится подробное описание цикла.

Lowenstem J.M. (ed.). Citric Acid Cycle: Control and Compartmentation, Dekker, New York, 1969.

Статьи

Hansford R. G. Control of Mitochondrial Substrate Oxidation, Curr. Top. Bioenerget., 10, 217-278 (1980). Подробное рассмотрение регуляции цикла лимонной кислоты.

Krebs Н. A. The History of the Tricarboxylic Acid Cycle, Perspect. Biol. Med., 14, 154 170 (1970). Увлекательный рассказ об открытии цикла лимонной кислоты.

Lowenstem J. М. The Tricarboxylic Acid Cycle, pp. 146 270. In: D. M. Greenberg (ed.). Metabolic Pathways, 3d ed., vol. 1, Academic, New York, 1967.

Reed L.J. Multienzyme Complexes, Acc. Chem. Res., 7, 40-46 (1974).

Srere P. A. The Enzymology of the Formation and Breakdown of Citrate, Adv. Enzymol, 43, 57-101 (1975).

Williamson D. H. Sir Hans Krebs, the First 80 Years. Trends Biochem., Sсi., 5, vi-viii, August 1980. Краткая биография.

Вопросы и задачи

1. Баланс цикла лимонной кислоты. В цикле лимонной кислоты для растепления ацетил-СоА используются восемь ферментов: цитрат-синтаза, аконитаза, изоцитратдегидрогеназа, а-кетоглутаратдегидрогеназа, сукцинил-СоА-синтетаза, сукцинатдегидрогеназа, фумараза и малатдегидрогеназа.

а) Напишите уравнение химического баланса для реакций, катализируемых каждым из этих ферментов.

б) Какой кофактор (или кофакторы) необходим для каждой из этих реакций?

в) Для каждого из ферментов укажите, к какому из перечисленных ниже типов принадлежит катализируемая им реакция: конденсация (образование углерод-углеродной связи): дегидратация (отщепление воды); гидратация (присоединение воды); декарбоксилирование (отщепление СОД; окисление - восстановление; фосфорилирование на уровне субстрата; изомеризация.

г) Напишите суммарное уравнение химического баланса для превращения ацетил-СоА в двуокись углерода.

2. Распознавание окислительно-восстановительных реакций в процессах метаболизма. Биохимическая стратегия живых организмов заключается в постадийном окислении органических соединений до двуокиси углерода и воды. Благодаря сопряжению этих реакций с другими реакциями значительная часть энергии, высвобождающейся при окислении, запасается в форме АТР. Важно уметь распознавать окислительно-восстановительные процессы в метаболизме, исходя из наблюдаемых химических превращений. Восстановление какой-либо органической молекулы происходит в результате гидрирования (присоединения водорода Н-Н) по двойной связи (1) или по простой связи - в этом случае с ее разрывом (2). Окисление же, наоборот, происходит в результате дегидрирования (отщепление водорода Н-Н). В биохимических окислительно-восстановительных реакциях (см. ниже, п. 3) функцию дегидрирования - гидрирования органических молекул выполняют в присутствии соответствующих ферментов сопряженные пары коферментов: NAD⁺ -NADH и FAD - FADH₂.

Укажите, что именно происходит (окисление или восстановление) в каждом из приведенных ниже метаболических превращений. Напишите уравнения химического баланса, добавив Н - Н.

3. Никотинамидные коферменты - переносчики водорода в обратимых окислительно-восстановительных реакциях (гл. 10). Никотинамидные коферменты могут вступать в обратимые окислительно-восстановительные реакции со специфичными субстратами в присутствии соответствующих дегидрогеназ. В окислительно-восстановительной реакции участвует никотинамидное кольцо кофермента; остальная часть его молекулы играет роль связывающей группы, которую узнает соответствующая дегидрогеназа. Формально источником водорода (Н - Н; см. п. 2) считается NADH + Н⁺. Когда кофермент окисляется, одновременно должен восстанавливаться субстрат:

Укажите для каждой из приведенных ниже реакций, что происходит с субстратом, т. е. окисляется ли он, восстанавливается или степень его окисления остается неизменной (см. п. 2). Для тех реакций, в которых происходит окисление или восстановление субстрата, напишите уравнения химического баланса, указав требуемые количества NAD⁺, NADH, Н⁺ и Н₂О. Задача состоит в том, чтобы распознать, нужен ли для той или иной реакции окислительно-восстановительный кофермент.

4. Стимулирование потребления кислорода оксалоацетатом и малатом. В начале 30-х годов Альберт Сент-Дьёрдьи сообщил об интересном наблюдении. Он добавлял к дышащим суспензиям измельченной грудной мышцы голубя оксалоацетат или малат и обнаружил, что потребление кислорода при этом усиливается. При измерении количества потребляемого кислорода было выявлено одно удивительное обстоятельство: количество потребленного кислорода в 7 раз превышало то, какое требовалось для полного окисления добавленного оксалоацетата или малата до двуокиси углерода и воды.

а) Почему добавление оксалоацетата или малата усиливает потребление кислорода?

б) Почему количество поглощенного кислорода во много раз превышает то, которое требуется для полного окисления добавленного оксалоацетата или малата?

5. Число молекул оксалоацетата в митохондрии. В последней реакции цикла лимонной кислоты происходит дегидрирование маната, в результате чего регенерирует оксалоацетат, необходимый для взаимодействия с ацетил-СоА в цитрат-синтазной реакции

а) Вычислите константу равновесия для этой реакции при 25°С.

б) Поскольку величина ∆G⁰' относится к стандартному значению pH, т.е. pH 7, константа равновесия, вычисленная, как в п. «а», равна

Как показывают измерения, концентрация L-малата в митохондриях печени крысы составляет приблизительно 0,20 мМ, а отношение концентраций NAD⁺/NADH равно 10. Вычислите концентрацию оксалоацетата в митохондриях печени крысы при pH 7.

в) Митохондрии из печени крысы имеют форму шариков диаметром около 2 мкм. Чтобы правильно оценить концентрацию оксалоацетата в митохондриях, определите число его молекул, приходящееся на одну митохондрию.

6. Изучение процесса дыхания в изолированных митохондриях. Можно изучать клеточное дыхание на препаратах изолированных митохондрий, наблюдая за тем, как изменяется поглощение кислорода этими препаратами в зависимости от условий. Если к активно дышащим митохондриям. использующим в качестве единственного источника «топлива» пируват, добавить 0,01 М малонат натрия, то дыхание внезапно прекращается и накапливается один из промежуточных продуктов метаболизма.

а) Какова структура накапливающегося промежуточного продукта?

б) Почему он накапливается?

в) Почему прекращается потребление кислорода?

г) Каким способом (кроме простого удаления малоната) можно снять вызванное малонатом ингибирование? Поясните свой ответ.

7. Опыты с мечеными соединениями на препаратах изолированных митохондрий. Метаболические пути, на которых совершаются превращения тех или иных органических соединений, часто изучают, используя меченые субстраты и прослеживая судьбу метки.

а) Как определить, действительно ли глюкоза, добавленная к суспензии изолированных митохондрий, расщепляется до СО₂ и Н₂О?

б) К препарату митохондрий добавили пируват, меченный ¹⁴С по метальной группе. Какое положение займет ¹⁴С в оксалоацетате после одного оборота цикла лимонной кислоты? Аргументируйте свой ответ, проследив судьбу метки на всем протяжении цикла.

в) Сколько оборотов цикла лимонной кислоты потребуется для того, чтобы весь ¹⁴С выделился в виде ¹⁴СО₂? Аргументируйте свой ответ.

8. Катаболизм 1-¹⁴С-глюкозы. Активно дышащую бактериальную культуру в течение короткого времени инкубировали с 1-¹⁴С-глюкозой, а затем выделили из нее промежуточные продукты гликолиза и цикла лимонной кислоты. Эти промежуточные продукты перечислены ниже. Укажите, какое положение занимает в каждом из них ¹⁴С. Учитывайте при этом только начальное включение ¹⁴С в молекулу.

а) Фруктозо-1,6-дифосфат

б) Глицеральдегид-3-фосфат

в) Фосфоенолпируват

г) Ацетил-СоА

д) Цитрат

е) а-Кетоглутарат

ж) Оксалоацетат

9. Синтез оксалоацетата в цикле лимонной кислоты. Оксалоацетат образуется на последней стадии цикла лимонной кислоты в результате NAD⁺-зависимого окисления L-малата. Возможен ли синтез оксалоацетата из ацетил-СоА под действием одних только ферментов и кофакторов цикла лимонной кислоты, без траты промежуточных продуктов цикла? Дайте подробный ответ. Как пополняется запас оксалоацетата?

10. Механизм действия фторацетата, применяемого в качестве родентицида Препарат фторацетата, изготовляемого промышленным способом, применяется как средство борьбы с грызунами. В природе фторацетат обнаружен в одном из южноафриканских растений. Проникнув в клетки, он превращается во фторацетил-СоА в реакции, катализируемой ферментом ацетаттиокиназой

Для изучения токсического действия фторацетата был проведен эксперимент на интактном изолированном сердце крысы. После перфузии сердца 0,22 мМ фторацетатом уменьшалось поглощение глюкозы и снижалась скорость гликолиза, а глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат накапливались. Концентрации всех промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты были при этом ниже нормы, и только концентрация цитрата превышала норму в 10 раз. а) В какой точке блокируется цикл лимонной кислоты? Почему цитрат накапливается, а запас других промежуточных продуктов цикла истощается?

б) Фторацетил-СоА подвергается ферментативным превращениям в цикле лимонной кислоты. Какова структура конечного продукта обмена фторацетата? Почему он блокирует цикл лимонной кислоты? Как можно снять это ингибирование?

в) Почему после перфузии сердца фтор-ацетатом уменьшается поглощение глюкозы и снижается скорость гликолиза? В чем причина накопления монофосфатов?

г) Почему отравление фторацетатом смертельно?

11. Синтез а-кетоглутарата. а-Кетоглутарат играет центральную роль в биосинтезе ряда аминокислот. Предложите последовательность известных ферментативных реакций, результатом которой будет реальный синтез а-кетоглутарата из пирувата. Эти реакции не должны предусматривать потребления каких-либо промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты. Напишите суммарное уравнение для предложенной вами последовательности реакций и укажите источник каждого реагирующего вещества.

12. Глиоксилатный цикл в семенах растений. Животные не могут синтезировать углеводы из жиров, потому что они не способны превращать ацетил-СоА (продукт расщепления жирных кислот) в пируват или оксалоацетат (соединения, необходимые для биосинтеза глюкозы). В случае же растений и некоторых микроорганизмов дело обстоит иначе. Благодаря имеющимся у них ферментам, изоцитрат-лиазе и малат-синтазе (рис. 16-18), они могут синтезировать оксалоацетат из ацетил-СоА в глиоксилатном цикле. В семенах высших растений содержатся большие количества масел, которые при прорастании служат источником жирных кислот, используемых в качестве предшественников для синтеза целлюлозы на ранних стадиях развития, когда синтетический аппарат еще не сформировался. Напишите уравнения известных ферментативных реакций, последовательность которых обеспечивала бы реальный синтез оксалоацетата, используемого для биосинтеза глюкозы, из ацетил-СоА. Ваша схема не должна предусматривать потребления какого-либо промежуточного продукта цикла лимонной кислоты. Напишите суммарное уравнение образования оксалоацетата из ацетил-СоА. Укажите источники всех кофакторов.

13. Катаболизм глюкозы. Гликолиз и пентозофосфатный путь. Изотопные методы дают возможность определить, какая часть катаболизма глюкозы в данной клетке или в данной ткани идет по гликолитическому, а какая - по пентозофосфатному пути. Клетки делят на две порции: одну инкубируют с 1-¹⁴С-глюкозой, а другую - с 6-¹⁴С-глюкозой. После этого сравнивают начальные скорости появления ¹⁴С в СО₂, образующейся в результате окисления глюкозы, у этих двух вариантов. Объясните, в чем заключается химический смысл такого подхода. Какими должны быть относительные начальные скорости образования ¹⁴СО₂ в клетках печени, если исходить из того, что катаболизм глюкозы распределен поровну между гликолитическим и пентозофосфатным путями?