Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993
Структура и функции белков и ферментов
Белки: структура и свойства
Определение четвертичной структуры
Определение четвертичной структуры олигомерных белков включает идентификацию протомеров каждого типа, определение их взаимной ориентации и изучение взаимодействий, стабилизирующих всю структуру.
Для определения молекулярной массы олигомера пригодны многие из применяемых для этой цели методов, лишь бы они не приводили к денатурации олигомера. Если же предварительно провести денатурацию олигомера, то можно теми же методами определить молекулярную массу протомера.
Ультрацентрифугирование
Этот метод, разработанный Сведбергом, основан на измерении скорости седиментации (осаждения) под действием центробежных сил. которые создается в ультрацентрифуге при ускорении порядка 105g.
Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы
Набор белковых стандартов и исследуемый белок наслаивают поверх налитого в пластмассовую пробирку раствора сахарозы, плотность которого изменяется так, что образуется градиент концентраций от 5 до 20%; далее в течение ночи проводят центрифугирование при ~105g. После этого дно пробирки прокалывают иголкой, содержимое собирают по каплям в небольшие пробирки, устанавливают относительное положение белков вдоль градиента плотности и проводят необходимые расчеты.
Фильтрация через молекулярные сита
Вначале проводят калибровку колонки с сефадексом или сходным наполнителем, используя набор белков известной молекулярной массы. Затем оценивают молекулярную массу неизвестного белка, сравнивая его подвижность с подвижностью стандартов. Однако, если белок представляет собой высокоасимметричную молекулу или же взаимодействует с наполнителем (молекулярным ситом), могут возникать серьезные ошибки.
Таблица 5.6. Четвертичная структура некоторых ферментов
|
Фермент (олигомер) |
Число протомеров |
Молекулярная масса протомера |
|
Аспартат-трансаминаза из сердца курицы (L-аспартат: 2-кетоглутарат аминотрансфераза, КФ 2.6.1.1) |
2 |
50000 |
|
Синтаза жирных кислот из печени голубя |
2 |
230000 |
|
Фруктозо-бисфосфатаза из печени кролика (D-фруктозо-1,6-бисфосфат-1-фосфогидролаза, КФ 3.1.3.11) |
22) |
29000 |
|
22) |
37 000 |
|
|
Орнитинтрансаминаза из печени крысы (L-орнитин:2-кетокислота—аминотрансфераза, КФ 2.6.1.13) |
4 |
33000 |
|
Пропионил-СоА-карбоксилаза из сердца свиньи (пропионил-CoA:CO2 лигаза [ADP], КФ 6.4.1.3) |
4 |
175000 |
|
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) из сердца, печени или мышцы быка (L-лактат: NAD оксидоредуктаза. КФ 1.1.1.27) |
42) |
35 000 |
|
Митохондриальная АТРаза из сердца быка (АТР-фосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) |
10 |
26000 |
|
Глутаминсинтаза из Е. coli (L-глутамат: NН лигаза [ADP], КФ 6.3.1.2) |
12 |
48 500 |
|
Ацетил-СоА-карбоксилаза из печени курицы (ацетил-СоА : СО2 лигаза [ADP], КФ 6.4.1.2) |
22) |
4100000 |
|
102) |
409000 |
1) Из обзора Klotz I. М., Langerman N.R., Darnall D. W.: Quaternary structure of enzymes. Amu. Rev. Biochem. 1970:39:25.
2) Неидентичные субьсдиницы.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Набор стандартных белков разделяют с помощью электрофореза в гелях различной пористости с содержанием поперечных сшивок 5—15%. Выявляют белок, окрашивая его кумасси синим или серебром, и определяют молекулярную массу, сравнивая подвижность белка и стандарта. Особенно широкое применение этот метод нашел при определении молекулярной массы протомера; сначала осуществляют денатурацию олигомера (например, кипячением в детергенте в присутствии ß-меркаптоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, содержащих ионный детергент — додецилсульфат натрия.
Электронная микроскопия
С помощью электронного микроскопа можно получать изображения малых объектов при линейном увеличении в 100000 раз. Это открывает возможность визуализации высокомолекулярных белков в составе вирусных частиц, ферментных комплексов, олигомерных белков.
В табл. 5.6 приведены выборочные данные о числе и молекулярной массе протомеров, из которых формируется четвертичная структура ряда ферментов.
Литература
Advances in Protein Chemistry, Academic Press, 1944-1987. (Ежегодник.)
Aisen P., Listowsky I. Iron transport and storage proteins, Annu. Rev. Biochem., 1980. 49, 357.
Baldwin R. L. Intermediates in protein folding, Annu. Rev. Biochem., 1975, 44,453.
Chou P. Y., Fassman G. D. Empirical predictions of protein structure, Annu. Rev. Biochem., 1978, 47, 251.
Croft L. R. Handbook of Amino Acid Sequences of Proteins, Joynson-Bruvvers Ltd. (Oxford, England), 1973.
Gurd F.N., Rothgeh T.M. Motions in proteins, Adv. Protein Chem., 1979, 33, 74.
Haschemeyer R. H., deHarven E. Electron microscopy of enzymes, Annu. Rev. Biochem., 1974, 43, 279.
Lennar: W. J. (ed.) The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Plenum Press, 1980.
Lijas A., Rossman M.G. X-ray studies of protein interactions, Annu. Rev. Biochem., 1974, 43, 475.
Neurath H.. Hill R.L. (ed.) The Proteins, 3rd ed., Academic Press. 1975.
Osborne J. C. Jr., Brewer H. B. Jr. The plasma lipoproteins, Adv. Protein Chem., 1977, 31, 253.
Smith L. C., Pownall H. J., Gott о A. M. Jr. The plasma lipoproteins: Structure and metabolism, Annu. Rev. Biochem., 1978, 47, 751.