Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980

Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Рестрикция и модификация ДНК
Рестриктирующие ферменты при расшифровке нуклеотидной последовательности ДНК

Благодаря способности расщеплять цепи ДНК в участках со строго специфичными нуклеотидными последовательностями, которые могут встречаться лишь по несколько раз на протяжении всей длины молекулы ДНК, рестриктирующие эндонуклеазы широко используются при определении последовательностей ДНК [217]. Их использование во многом напоминает применение трипсина для расщепления полипептидных цепей на более мелкие фрагменты (гл. 2, разд. 3,2). Хорошим примером использования рестриктирующих ферментов может служить изучение нуклеотидной последовательности ДНК вируса SV40 [218, 219]. Этот вирус млекопитающих, способный включаться в геном клетки-хозяина, превращая клетку в опухолевую, содержит кольцевую двухцепочечную ДНК, состоящую приблизительно из 5000 нуклеотидных пар. Один из рестриктирующих ферментов Hemophilus influenzae расщепляет ДНК вируса SV40 на 11 фрагментов, тогда как в результате действия фермента Hemophilus parainfluenzae образуются только четыре фрагмента. Фермент Eco RI из Е. coli разрывает кольцевую ДНК лишь в одной-единственной уникальной точке. Анализ продуктов частичного гидролиза и перекрывающихся фрагментов позволил установить местоположение всех фрагментов на кольцевой карте. Используя импульсную метку тимином, удалось сопоставить положение начальной точки и направлений двусторонней репликации с положением фрагментов, образующихся под действием рестриктирующих ферментов. Аналогичным образом было установлено направление ранней и поздней транскрипции в продуктивно инфицированных клетках. Изучение нуклеотидных последовательностей отдельных фрагментов продвигается столь успешно, что в ближайшее время, возможно, удастся расшифровать полную нуклеотидную последовательность молекулы вируса SV40. Аналогичные методические подходы уже используются для изучения митохондриальных и хлоропластных ДНК, а также отдельных фрагментов хромосомной ДНК.