Биохимия - Химические реакции в живой клетке Том 3 - Д. Мецлер 1980
Биохимическая генетика и синтез нуклеиновых кислот и белков
Генетические методы
Плазмиды и эписомы
Эффективный метод исследования основан на существовании в бактериях небольших генетических элементов, существующих вне хромосомы. Об одной группе таких элементов (или факторов), получившей название F-факторов, уже шла речь выше (разд. А, 1, г). Эти элементы, представляющие собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, являются представителя ми Группы; включающей большое число подобных агентов, известных под общим названием плазмид и эписом [14, 146, 147]. К этой группе относятся также колициногенные факторы и факторы устойчивости к антибиотикам (R-факторы). Репликация плазмид происходит независимо от репликации хромосомы, причем на одну хромосому в бактерии может приходиться одна или несколько одинаковых плазмид. Эписомы — это плазмиды, способные включаться в хромосому бактерии. Некоторые внехромосомные элементы могут вести себя как эписомы в одних бактериях и как плазмиды в других. Плазмиды могут быть инфекционными (переносимыми) или неинфекционными. В первом случае они содержат гены для синтеза половых пилей (разд. А, 1, г) и способны переносить свою ДНК в другую клетку. Если плазмида способна интегрироваться с хромосомой, а потом и выходить из нее, захватывая с собой при этом другие гены, то такую плазмиду называют фактором пола. Выше уже шла речь о том, что процесс переноса генов с помощью фактора F был широко использован при картировании бактериальных хромосом.
Размеры плазмид и эписом могут быть различными. Половой фактор F-1 представляет собой кольцевую суперспирализованную ДНК, мол. вес которой составляет приблизительно 62∙106. Такой размер достаточно велик для того, чтобы этот фактор мог содержать около 90 генов и иметь длину порядка 30 нм, что составляет 2,5% размера хромосомы Е. coli. Колициногенные факторы [148], которые также могут присутствовать в клетках Е. coli в количестве 10—15 копий на одну бактериальную хромосому, имеют обычно меньшие размеры: их мол. вес составляет приблизительно 4∙106—5∙106. Некоторые более крупные колициногенные факторы одновременно являются и половыми факторами. Эти плазмиды переносят гены, детерминирующие синтез токсических белковых антибиотиков, известных под названием колицинов, способных атаковать другие штаммы Е. coli. Плазмида переносит также ген (или гены), придающий устойчивость по отношению к токсинам, в бактериальную клетку-хозяина. Действие колицина Е-3 состоит в том, что он проникает в чувствительную к нему бактериальную клетку и подавляет синтез белка, отсекая маленькие фрагменты от 3'-конца каждой молекулы бактериальной 16S рРНК [149] (рис. 15-14).
Большое внимание было уделено факторам устойчивости к антибиотикам. В связи с тем что антибиотики находят широкое применение, возникает важная проблема, связанная с быстрым развитием у бактерий устойчивости к ним. Эта проблема может приобрести особенно важное значение в случаях, если антибиотики используются без специального выбора, поскольку гены устойчивости могут свободно передаваться от одной бактерии к другой при помощи инфекционных плазмид R-факторов [150—152]. Поскольку одна и та же плазмида может переносить гены устойчивости к самым различным антибиотикам, могут образовываться «супербактерии», устойчивые к действию самых разных антибиотиков. Появление таких бактерий, вероятность которого особенно велика в больницах, может повлечь за собой серьезные эпидемии инфекционных заболеваний, устойчивых к антибиотикам. Механизмы резистентности часто связаны с инактивацией антибиотиков. Аминогликозиды, такие как, например, стрептомицин (дополнение 12-А) и канамицин, инактивируются ферментами, катализирующими процессы фосфорилирования или аденилирования специфических гидроксильных групп сахарных колец. Пенициллин (дополнение 7-Г) инактивируется пенициллиназой, расщепляющей гидролитически кольцо ß-лактама. Хлорамфеникол (рис. 14-25) инактивируется путем ацилирования одной или двух гидроксильных групп.
Каково происхождение факторов устойчивости к антибиотикам? Почему в природе так широко распространены гены, обеспечивающие инактивацию столь необычных молекул, как антибиотики? Возможно, это объясняется тем, что гены устойчивости к антибиотикам в обычной ситуации выполняют какие-то нормальные биосинтетические функции, но наличие в среде антибиотиков приводит к отбору мутантов, гены которых способны обеспечивать их инактивацию. Тем не менее до конца не ясно, почему факторы, обеспечивающие устойчивость к лекарственным препаратам, появляются так часто именно в популяции, обработанной антибиотиком. Частичным решением проблемы устойчивости послужило создание полусинтетических модификаций антибиотиков, встречающихся в природе. Поскольку R-факторы переносят гены, ответственные за синтез ферментов, изменяющих специфические участки антибиотика, иногда удается химически изменить эти участки таким образом, чтобы они больше не участвовали в ферментативной реакции, индуцируемой R-фактором.
Часто отмечают сходство между инфекционными плазмидами и вирусами [153]. Так, например, нитевидные бактериофаги (дополнение 4-В и рис. 4-8) [154] выходят из бактериальной клетки благодаря накоплению в толще мембраны гидрофобных белковых субъединиц, формирующихся в тонкие микротрубочки диаметром около 6 нм, внутри которых содержатся молекулы ДНК, готовые для переноса в другие бактериальные клетки. Фаг адсорбируется на F-пилях бактерии мужского пола, после чего ДНК с помощью пока еще не изученного механизма проникает в клетку [155]. Точно так же как нитевидные бактериофаги переносят гены, обеспечивающие синтез белковых субъединиц их оболочки, половые факторы F переносят гены, ответственные за синтез пилинов. Пилин также накапливается в клеточной мембране и, вытесняясь, расходуется на генерирование F-пили. Таким образом, можно думать, что между плазмидами и вирусами существует тесная взаимосвязь. Одним из результатов переноса ДНК от штамма Hfr к бактериям F- является проникновение копии фактора F в женскую бактерию. Поскольку при этом клетка-реципиент превращается из женской в мужскую, Бринтон назвал «пол бактерий вирусным заболеванием». Очень близкое сходство существует также между эписомами, способными включаться в бактериальные хромосомы, и «умеренными» бактериофагами, о которых пойдет речь в следующем разделе.