Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Структура белков
Структура белков
Установление структуры N-концевых остатков пептидных цепей

Структуру N-концевого остатка пептидных цепей можно можно установить следующими методами.

> С помощью реагента Сенджера (Сенгера) (предложен в 1945г.) - 2,4-динитрофторбензол (ДНФ). Свободная непротонированная аминогруппа N-концевой аминокислоты полипептида реагирует с ДНФ в щелочной среде с образованием окрашенных в желтый цвет 2,4-динитрофенильных производных (ДНФ-производное аминокислоты). Это производное устойчиво в процессе кислотного гидролиза пептида и легко выделяется из смеси аминокислот по завершению расщепления. Структура N-концевой аминокислоты устанавливается по “свидетелю” при хроматографировании ДНФ-производных эталонных аминокислот.

Первую стадию реакции проводят при Т = 25 - 37⁰С, рН=7 - 8. Вторая стадия - обычный кислотный гидролиз белка (110 ∘С, в среде 6н HCl).

Метод обладает ограниченной специфичностью. ДНФ реагирует не только с а-аминогруппой концевой аминокислоты, но и с s-аминогруппами лизина, SH-группами цистина, ОН-группами тирозина, имидазольными группами гистидина. Тем не менее, s-ДНФ-лизин легко отличить с помощью специального свидетеля, а все остальные побочные ДНФ-производные бесцветны и не мешают проведению анализа на N-концевую аминокислоту.

Вместо ДНФ для определения N-концевой аминокислоты можно использовать пипсилхлорид (п-иодфенилсульфофенилхлорид), который образует следующий продукт присоединения к N-концевой аминокислоте:

Особенность этого метода в том, что в пипсилхлорид вводят в качестве метки радиоактивный иод и определяют пипсилпроизводное радиометрически.

> Более удобный метод определения N-концевой аминокислоты - это метод Эдмана. В нем используется фенилизотиоцианат (ФИТЦ) - реагент Эдмана. ФИТЦ реагирует с N-концевой аминокислотой пептида с образованием фенилтиокарбамоильного производного. При дальнейшей обработке кислотой происходит его циклизация с образованием фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты. В процессе циклизации эта аминокислота отщепляется от пептидной цепи. Вся остальная цепь пептида сохраняется неизменной. Таким образом, по методу Эдмана модифицированный N-концевой остаток отщепляется без разрушения полипептидной цепи.

Схема реакции с фенилизотиоцианатом:

> Иногда, для определения N-концевого остатка используют аминопептидазы. Эти ферменты последовательно отщепляют аминокислоты со стороны N-конца пептидной цепи. Наиболее изученным ферментом этого типа является лейцинаминопептидаза. Ее выделяют из почек свиньи. С помощью этого энзима были установлены, в частности, N-концевые аминокислоты в инсулине и рибонуклеазе. Фермент плохо отщепляет концевые аминокислоты, если они соединены с лизином, аргинином и ароматическими аминокислотами.

После установления структуры N- и С-концевых аминокислот приступают к выяснению аминокислотной последовательности полипептидной цепи.