Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Структура белков
Структура белков
Фрагментация белковых цепей - Ферментативная фрагментация

Наиболее часто для ферментативного расщепления белков на фрагменты используются пищеварительные ферменты млекопитающих. Такие, например, как трипсин, химотрипсин и некоторые другие. В отличии от амино- и карбоксипептидаз, которые действуют на концевые аминокислоты пептидных цепей и получили название экзопиптидаз, трипсин, химотрипсин и другие аналогичные ферменты расщепляют пептиды во внутренних звеньях цепи. Их называют, поэтому, эндопептидазами.

Все эти ферменты не обладают абсолютной специфичностью к природе расщепляемой связи, но в тщательно подобранных условиях они расщепляют все же предпочтительно определенные связи, т.е. проявляют так называемую.

“сайт-специфичность”. Данные по специфическому гидролизу петидных цепей некоторыми ферментами приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1 Специфическая активность некоторых ферментов при расщеплении пептидных цепей.

Протеазы с высокой специфичностью

Фермент

рН

Основной тип гидролиза

Побочный тип гидролиза

Не затрагиваемые связи

Трипсин

7-9

Лиз-↓-Х, Арг-↓-Х,

Лиз-Про

Тромбин

8

Арг-↓-Х (Х=Гли, Ала, Вал, Цис, Арг, Асп

Протеаза V8 из Staphylococus aureus (S.aureus)

4 и 7.8

Глу-↓-Х

Асп-↓-Х

Глу-Про

Гли-Глу

Клострипаин

7.7

Арг-↓-Х

Лиз-↓-Х

Протеаза, из подчелюстной желзы мыш

7.5

8

Арг-↓-Х

Арг-Вал

Арг-Арг

Протеаза

A.mellea

8

Лиз-↓-Х

Арг-↓-Х

Х-Про

Протеаза myxobacter AL1

9

Х-↓-лиз

Постпролинспецифичная протеаза

7.5

8

Про-↓-Х

Про-Про

Протеазы с широкой специфичностью

Химотрипсин

7-9

Н-↓-Х (Н=Тир,Фен,Три,Лей)

Н-Про

Термолизин

7-8

Х-↓-Н (Н=Вал,Лей,Иле,Фен,Тир,Три)

Х↓*Н-Про

а-Протеаза Crotalus Atrox

7.5-8

Х4-Н (Н=Вал,Лей,Иле,Фен,Тир,Три)

Пепсин

2

Х↓Н↓Y, X↓Глу↓Y (H=ароматический или объемный алифатический остаток)

Папаин

5

7.5

Фен-Х↓Y. Идет гидролиз и некоторых других пептидных связей.

Эластаза

7-9

N-↓-Y (N=небольшой нейтральный или гидрофобный остаток Сер,Ала,Гли,Вал,Лей)

а-Литическая протеаза

7-8

N-↓-Y (Аналогично эластазе)

Подбор оптимальных условий для ферментативного гидролиза сводится в общем случаю к оптимизации:

> состава буфера;

> соотношения фермент: субстрат;

> температуры;

> времени проведения процесса.

Буферные системы. Обычно используют легко летучие буферные смеси. Например 1% бикарбонат аммония и 100 мМ N-этилморфолилацетат.

Соотношение фермент: субстрат - на уровне 1:50-100.

Температура - в большинстве случаев -20-37∘С. Только два фермента - термолизин и протеаза из миксобактерий сохраняют высокую активность при температурах > 40∘С.

Продолжительность гидролиза, как правило, 2-4часа. Если связь трудно расщепляемая увеличивают время до 16-24 ч.

Торможение ферментативной реакции гидролиза по истечению заданного промежутка времени можно осуществить путем:

> замораживания;

> изменения рН среды;

> введением специфичных ингибиторов.

Протеолитические ферменты подразделяются на три основных класса:

> сериновые протеазы;

> сульфгидрильные протеазы;

> металлоферменты.

Специфическими ингибиторами сериновых протеаз являются диизопропилфторфосфат (ДФФ) и фенилметилсульфофторид (ФМСД).

Последний предпочтительнее, поскольку ДФФ высоко токсичен.

Image

Сульфгидрильные протеазы ингибируются избытком алкилирующих агентов, например, иодуксусной кислотой. Металлоферменты ингибируют хелатирующими добавками. Это может быть в частности, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).