Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Структура белков
Структура белков
Фрагментация белковых цепей - Характеристика протеаз с высокой специфичностью

Из ферментов этого типа наиболее важен трипсин. Широкое применение находит также протеаза V8 из S. aureus. Этот фермент гидролизует пептидные связи по остаткам дикарбоновых кислот, в основном глутаминовой. Недавно выделена новая протеаза из мутанта Pseudomonas fragi, которая гидролизует связь по аминогруппе остатков аспрагиновой и цистеиновой кислот.

Трипсин - сериновая протеаза. Один из наиболее доступных высокоспецифичных ферментов. Его получают из различных источников. Специфичность трипсина не абсолютная. Он гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы лизина и аргинина со всеми остальными белковыми аминокислотами, кроме Про. Присутствие кислотных остатков вблизи атакуемой связи резко уменьшает скорость гидролиза или вообще останавливает его. Скорость снижают также положительно заряженные группы.

Описаны случаи неспецифического действия трипсина, когда гидролизу подвергались пептидные связи расположенные вблизи ароматических или гидрофобных аминокислотных остатков, а также расщепление связей Арг-Про в цепочках Три-Арг-Про-Ала и Ала-Арг-Про-Ала.

Условия гидролиза. Трипсин имеет максимальную активность при рН=7- 9. Обратимо инактивируется при рН<4. Склонен к автолизу (авторасщепление), поэтому фермент растворяют в 10 мМ HCl и хранят замороженном состоянии. В этих условиях он устойчив неделями. Гидролиз трипсином проводят в 0.1 М аммонийбикарбонатном буфере при соотношении фермент : субстрат 1:50-100, Т=37∘С, в течении 1 - 4 часов. Фермент необратимо инактивируется (ингибируется) ДФФ и ФМСФ. Для трипсина известен ряд специфичных ингибиторов, например трипсиновый ингибитор из сои.

Тромбин - доступный и высокоспецифичный фермент, однако для расщепления белков практически не применяется. Причина, вероятно, в том, что выпускаемые различными фирмами препараты тромбина широко варьируют по степени очистки и активности.

Протеаза V8 из Staphylococus aureus. Эту сериновую протеазу выделяют из штамма S.aureus и производят серийно в форме коммерческого препарата.

Специфичность - расщепляет в основном пептидную связь со стороны карбоксильной группы глутаминовой кислоты с любой другой аминокислотой кроме Про и Глу. На субстратную специфичность влияет состав буферной смеси. Известны случаи неспецифического действия. Затрагивается главным образом связь Сер-Х.

Условия гидролиза: рН=3.5-9.5, максимальная активность наблюдается при двух значениях рН: 4.0 и 7.8. Буфер - 50 мМ ацетат аммония. Т=37∘С, время гидролиза - до 18 часов. Ингибируется ДФФ. Фермент сохраняет активность в 0.2% растворе дансилнатрия (ДСН) и 50% активности в 4 М мочевине. Это позволяет применять его в денатурирующих условиях.

Клострипаин - сульфгидрильная протеаза. Выделена из Clostridium histolyticum. Фермент выпускают в виде коммерческого препарата.

Специфичность - гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы аргинина с любой другой аминокислотой. Иногда расщепляет связь Лиз-Х. Это направление гидролиза можно ограничить или пресечь, варьируя условия. Условия гидролиза - максимум активности при рН=7.7 в присутствии сульфгидрильных реагентов. Способствуют гидролизу ионы Са²⁺, хотя их присутствие не обязательно. Соотношение фермент: субстрат - 1:50. Буфер - 100 мМ NH₄HCO₃в дитиотреите (ДТТ): SHCH₂-CH(OH)-CH(OH)-CH₂SH. Температура - 25∘С, время - 4 часа.

Протеаза из подчелюстной железы мыши - сериновая протеаза. Выделена из подчелюстной железы мыши. Расщепляет пептидные связи со стороны карбоксильной группы аргинина со всеми аминокислотами, за исключением связей Арг-Вал, Арг-Арг. По специфичности фермент аналогичен клострипаину, однако практически не затрагивает связи Лиз-Х.

Условия гидролиза: буфер - 1% NH₄HCO₃, рН=8, Т=37∘С, время до 24 часов соотношение фермент : субстрат - 1 : 50. Гидролиз тормозится подкислением среды соляной кислотой до рН=1.5-2.

Протеаза из Armillaria mellea представляет собой Zn²⁺-содержащий металлопротеин. Фермент выделен и получен в виде чистого активного препарата с молекулярной массой 14000 и максимумом активности при рН=6.8. В виде коммерческих образцов пока не производится.

Специфичность. Гидролизует пептидные связи со стороны аминогруппы лизина и аминоэтилцистеина (Аес) типа Х-Лиз, даже если Х=Про. Устойчивы к действию фермента пептидные связи, содержащие вблизи остатков Лиз кислотные остатки. Иногда расщепляет связь Арг-Х (со стороны карбоксильной группы Арг). Степень гидролиза возрастает если Х = Лей, Иле.

Условия гидролиза: - 0.2 М N-этилморфолинацетатный буфер, рН=8, соотношение фермент : субстрат - 1:100, Т=35∘С, время до 22 часов, или 0.1 М NH₄HCO₃, соотношение 1:500-1000, Т=37∘С.

Постпролинспецифичный фермент. Пролин - редкая аминокислота. Пока известен и испытан только один постпролинспецифичный фермент, выделенный из почек ягненка. По предварительным данным - это сериновая протеаза.

Специфичность. На коротких пептидах (не более 13 аминокислот) показано, что фермент расщепляет все связи Про-Х, за исключением Про-Про. Скорость гидролиза зависит от Х. Она максимальна, если Х обладает гидрофобными свойствами и минимальна если Х - кислая или основная аминокислота.

Фермент затрагивает связи Ала-Х, но скорость гидролиза в 100-1000 раз меньше, чем по связи Про-Х.

Условия гидролиза: рН = 7.5 - 8.0 (максимум активности), буфер 100 мМ NH₄HCO₃ и по 1мМ ДТТ и ЭДТА, температура 22∘С, время 24ч.