Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Структура белков
Структура белков
Фрагментация белковых цепей - Характеристика протеаз с широкой специфичностью

Ниже кратко описаны не все протеазы этого класса, но большинство из часто применяемых в лаборатории.

Химотрипсин - сериновая протеаза. Один из наиболее специфичных ферментов этого класса. Он широко применяется для получения первичных гидролизатов.

Специфичность - гидролизует, в основном, пептидные связи со стороны карбоксильной группы ароматического или объемного гидрофобного остатка аминокислоты типа Н-Х, где Х=Тир, Три, Фен, Лей. Устойчива связь Н-Про. Может расщеплять также по остаткам Гис, Иле, Мет, Сер, Вал.

Условия гидролиза: 100 мМ NH₄HCO₃, соотношение фермент : субстрат - 1 : 50, Т = 37⁰С, время 4 ч. Ингибируется соевым ингибитором трипсина.

Термолизин применяется очень широко для определения аминокислотной последовательности белков. Производится в виде коммерческого препарата.

Специфичность: гидролизует пептидные связи со стороны аминогруппы гидрофобных аминокислотных остатков типа Х-Н, где, в большинстве случаев, Н= Вал, Лей, Иле, Фен, Тир, Три. Хорошо гидролизует также пептидные связи с Ала, фрагмент Про-Иле. Редко отмечается гидролиз по остаткам: Асн, Тре, Гис, Глу. Гидролиз термолизином ингибируется соседними а-амино- или а-карбоксильными группами, следовательно, он не обладает экзопептидазной активностью (по пептидной связи с концевой аминокислотой). Амино- и карбоксильные группы в боковых цепях аминокислот не оказывают заметного влияния на активность фермента.

Протеаза получила название "Термолизин" потому, что сохраняет 100% активность в течении 1ч при Т=60∘С, и значительную активность при 80∘С. Кроме того, этот фермент устойчив в 8 М мочевине, 20% этаноле или метаноле. В этих условиях, однако, повышается вероятность его термической денатурации.

Условия гидролиза: рН = 7 - 8, требует наличия ионов Са²⁺, буфер: 100 мМ NH₄HCO₃, содержащий 5мМ СаСl₂, соотношение фермент : субстрат 1:50, Т=37∘С, время - 4 ч. Фермент ингибируется ЭДТА.

Пепсин - практически единственная хорошо изученная и доступная в виде коммерческого препарата кислая протеаза.

Специфичность: расщепляет, преимущественно, пептидные связи с ароматическими и объемными алифатическими аминокислотными остатками. Характеризуется, к сожалению, выраженной специфичностью и к ряду других пептидных связей, поэтому окончательный результат частичного гидролиза предсказать трудно. Фермент применяется для ограниченного протеолиза нативных белков.

Условия гидролиза: рН = 1 - 5 (оптимум рН = 2), буфер - 10 мМ HCl или 5% CH₃COOH. Инкубация с пепсином приводит к получению коротких пептидов с правильно замкнутыми дисульфидными связями. Фермент необратимо ингибируется при рН > 6.

Папаин - сульфгидрильная протеаза. Ее выделяют из латекса дынного дерева. Налажено производство препарата в товарном виде рядом фирм.

Специфичность: в целом, папаин гидролизует самые разнообразные пептидные связи, поэтому результат гидролиза практически непредсказуем. Фермент применялся для получения крупных фрагментов нативных белков. Например, иммуноглобулинов, миозина, экстрацеллюлярного фрагмента антигенов гистосовместимости человека и др.

Условия гидролиза: максимум активности в диапазоне рН = 5 - 7.5, активацию фермента проводят в присутствии сульфгидрильных реагентов, буфер-0.2 М пиридин-ацетатный буфер (рН = 6.5) с добавкой 1% 2,3-димеркаптопропанола-1, соотношение фермент : субстрат 1 : 50, Т = 37∘С, время гидролиза - 1ч. Фермент инактивируется при окислении солями тяжелых металлов или цианат-ионами в присутствии цистеина. Устойчив в деионизированном растворе мочевины (вплоть до 8 М мочевины).

Эластаза - сериновая протеаза, гомологичная трипсину и химотрипсину. Производится несколькими фирмами.

Специфичность: обладает широкой специфичностью. Гидролизует преимущественно пептидные связи по карбоксильной группе аминокислот с небольшим углеводородным (гидрофобным) радикалом в боковой цепи, например Ала. Условия гидролиза такие же как для трипсина и химотрипсина.

а-Протеаза из Crotalus atrox - выделяют из яда Crotalus atrox. Выпускается в товарном виде. Специфичность: гидролизует пептидные связи со стороны аминогруппы гидрофобных аминокислотных остатков. По специфичности аналогична термолизину. Условия гидролиза окончательно не установлены. Максимум активности в диапазоне рН = 7.5 - 8.

На практике наиболее часто используют трипсин, химотрпсин, термолизин и протеиназу V8 из Staphylococus aureas.

Различают исчерпывающий и ограниченный протеолиз. Исчерпывающему гидролизу подвергается, как правило, белок в денатурированном состоянии. Нативный белок гидролизуется по поверхности глобулы. Ограниченный протеолиз можно осуществить в условиях, когда активность фермента понижена: уменьшение температуры, выбор значений рН за пределами оптимальных, уменьшение соотношения фермент - субстрат и т.д.