Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы разделения белков
Экспериментальные методы электрофореза - Электрофорез на бумаге

Аминокислоты, пептиды и белки можно анализировать методом электрофореза на бумаге. Наилучшие результаты получаются при использовании напряжений до 1 кВ.

Методика электрофореза проста. Полоску или лист хроматографической бумаги равномерно увлажняют токопроводящим буферным раствором. Закрепляют в специальной ванночке между двумя электродными отделениями, которые заполнены токопроводящим раствором (см. рис.4.4).

Рис. 4.4 Принципиальная схема установки для низковольтного (А) и высоковольтного (Б) электрофореза на бумаге.

1 - крышка; 2- полоска бумаги; 3 - вода для поддержания постоянной величины насыщенных паров; 4,5 - кюветы с буферным раствором; 6 - токопроводящий фитиль; 7 - охлаждающие пластины; 8 - заполненный воздухом мешок.

Анализируемый образец наносят у края или по центру листа. После подачи напряжения компоненты смеси движутся в направлении соответствующих электродов.

Низковольтный электрофорез малоэффективен для небольших молекул (например, аминокислот и нуклеотидов), поскольку из-за малого заряда они обладают низкой подвижностью. Они медленно разделяются и для них имеет место значительное размывание зон за счет диффузии. При высоковольтном электрофорезе скорость разделения увеличивается за счет значительного градиента потенциала (200 В/см) Высокое напряжение обусловливает большую силу тока, бумага нагревается, поэтому здесь необходимо охлаждение. Для охлаждения бумагу погружают в большой объем несмешивающейся и не проводящей ток жидкости или прижимают ее к охлаждающей поверхности. После окончания электрофореза бумагу высушивают, и вещества определяют так же, как и при низковольтном электрофорезе.

Высоковольтный электрофорез на бумаге имеет большую ценность для разделения аминокислот и пептидов. Поскольку полное разделение смесей не всегда возможно при использовании одного высоковольтного электрофореза, его часто используют в сочетании с хроматографией. Этот метод известен под названием двухмерного разделения. Образец вначале подвергают электрофорезу, а затем хроматографируют под прямым углом или наоборот (см. рис. 4.5).

Рис. 4.5 Сочетание электрофореза с хроматографией для разделения сложных смесей. А - только хроматография; Б - хроматография с последующим ЭФ

Помимо бумаги, в качестве твердой пористой основы для проведения электрофореза можно использовать крахмал, ацетат целлюлозы, агарозу, полиакриламидный гель (ПААГ).