БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 1

ЧАСТЬ I. КОНФОРМАЦИЯ И ДИНАМИКА

ГЛАВА 6. ВВЕДЕНИЕ В ЭНЗИМОЛОГИЮ

6.10. V_max и К_м можно определить, используя различные концентрации субстрата

Если фермент работает в соответствии с простой схемой, представленной в уравнении (1), то нетрудно определить его константу Михаэлиса К_м и максимальную скорость Vmaxпутем измерения скорости реакции при различных концентрациях субстрата. Удобно преобразовать уравнение Михаэлиса— Ментен в такую форму, чтобы графически оно выражалось прямой. Для этого уравнение (15) представляют в виде обратных величин:

(16)

Откладывая 1/V против 1/[S], получаем прямую, пересечение которой с осью ординат дает 1/Vmax, а угол наклона равен Км/Vmax (рис. 6.13).

Рис. 6.13. Изображение кинетики ферментативной реакции на графике двойных обратных величин: 1/V выражена как функция 1/[S]. Наклон кривой равен K/_M/V_mах, точка пересечения с осью у соответствует 1/V_mах, точка пересечения с осью X = 1 /К_м

6.11. Значение величин К_м и V_mах

К_м для разных ферментов варьирует в широком диапазоне величин (табл. 6.1). Для большинства ферментов величина К_м лежит в пределах 10^-1 — 10^-6 М. Значение К_м фермента зависит от природы субстрата, а также от условий среды: температуры, ионной силы. Константа Михаэлиса К_м имеет два смысловых значения. Во-первых, К_м-это концентрация субстрата, при которой занята половина активных центров фермента. Если известна К_м, то можно рассчитать, какова доля занятых активных центров ƒ_ES для любой концентрации субстрата:

(17)

Таблица 6.1. Величины К_м некоторых ферментов

Во-вторых, К_м связана с константами скоростей отдельных этапов катализа, представленных в уравнении (1). Согласно уравнению (7), Км равна (к₂+к₃)/к₁. Рассмотрим крайний случай, когда к₂ намного выше к₃, т.е. диссоциация комплекса ЕS на Е и S происходит гораздо быстрее, чем образование Е плюс продукта реакции. В этих условиях (к₂ » к₃)

(18)

Константа диссоциации комплекса ЕS описывается уравнением

(19)

Другими словами, если к₃ намного меньше, чем к₂, то К_м равна константе диссоциации ЕS-комплекса. При указанном условии К_м служит мерой прочности ЕS-комплекса: высокая К_м-показатель слабого связывания субстрата; низкая К_м - показатель сильного фермент-субстратного взаимодействия. Следует еще раз подчеркнуть, что по значению К_м можно судить о сродстве фермента к субстрату только при условии, что к₂ значительно больше к₃. В действительности так оно и бывает во многих, хотя и не во всех случаях.

Максимальная скорость V_max отражает число оборотов фермента, если известна концентрация активных центров (E_T), так как

V_max = k_з [E_Т]. (20)

Например, при полном насыщении субстратом растворенная карбоангидраза в концентрации 10^-6 М катализирует образование 0,6 М Н₂СО₃ в секунду. Отсюда к₃ = 6 • 10^-5 с^-1. Кинетическая константа к₃ называется числом оборотов. Число оборотов фермента, это то количество молекул субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом. Число оборотов 6 • 10⁵ с^-1, характерное для карбоангидразы, самое большое из всех известных. Каждый новый каталитический акт происходит через промежуток времени, равный 1/k₃, что для карбоангидразы составляет 1,7 мкс. Число оборотов большинства ферментов при использовании физиологических субстратов находится в пределах 10⁴ в секунду (табл. 6.2).

Таблица 6.2. Максимальное число оборотов некоторых ферментов