Клинико-морфологическая диагностика и лечение заболеваний, передающихся половым путем - Якимова Т. П. 2007

Методы получения биоматериала для цитологического исследования
Методы окраски цитологических препаратов

Наиболее распространенными методами окраски цитологических препаратов являются окраска 1%-ным раствором метиленового синего красителя, по методу Нохта, Паппенгейма, а также Романовского-Гимза.

В то же время довольно часто препараты красят по Алексееву, Лейшману и другими способами.

ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ПАППЕНГЕЙМА

Окраска по методу Паппенгейма считается наиболее оптимальной в лабораторной практике. Для окраски по этому методу необходимы краска-фиксатор Май-Грюнвальд, основные 1%-ные растворы азура II и эозина.

Для окраски этим методом высушенные на воздухе мазки фиксируют краской-фиксатором Май- Грюнвальда в течение 3-х минут. Через 3 минуты, не сливая краски, на стекло осторожно наливают такой же объем дистиллированной воды. После этого через минуту краску сливают со стекла и, не ополаскивая мазка, наливают на него рабочий раствор азур-эозиновой смеси на 10-30 минут в зависимости от индивидуального подбора времени экспозиции данной партии краски. Только после окончательной окраски препараты споласкивают дистиллированной или водопроводной водой. Экспозицию окраски препаратов выбирают опытным путем для каждой новой партии окраски отдельно.

Для приготовления азур-эозиновой смеси в качестве рабочего раствора на 1 мл дистилированной воды при pH 6,8 берут 1 -4 капли основного раствора эозина и 1 - 4 капли основного раствора азура II. Количество воды берут в зависимости от количества мазков, которые имеются для изучения. На 1 цитологический препарат расходуют 3 - 4 мл свежеприготовленного красителя.

Азур-эозиновые смеси в готовом виде имеют название краски Романовского - Гимза. Но эта краска при хранении нестойкая и дает осадок. Поэтому в лаборатории основные растворы красок готовят отдельно. Для этого 1 г краски азура II растворяют в 1 л дистилированной воды, которую кипятят непосредственно перед приготовлением краски. Второй раствор готовят из эозина. Для этого 1 г эозина натрия или калия растворяют в 1 литре свежеприготовленной дистилированной воды. Каждую краску хранят в отдельной посуде. Такие растворы неограниченно долго стойки. Перед окраской цитологических препаратов из основных 1%о раствора азура II и эозина готовят рабочие растворы. В отличие от основных растворов, которые хранятся долго, рабочий раствор может быть использован только в день приготовления смеси красок. Рабочий раствор смеси красок готовят в следующем соотношении: 40 мл раствора азура, 30 мл раствора эозина и 70 мл дистилированной воды. Длительность окраски цитологических препаратов составляет 10-30 минут в зависимости от материала и титра красок. В продаже имеются готовые красители, которыми обычно пользуются в лаборатории. Рабочее разведение красок готовят в день окрашивания мазков, используют разведение красителя 1:10 в дистиллированной воде.

ОКРАСКА ПО ЛЕЙШМАНУ

Высушенный на воздухе мазок фиксируют в фиксаторе Лейшмана 3 минуты. Фиксатор сливают, мазок на предметном стекле промывают проточной водопроводной водой, а затем окрашивают мазок краской Романовского - Гимза в течение 10-20 минут. Готовую краску Романовского разводят водой из расчета 15 капель готового основного раствора краски на каждые 10 мл дистилированной воды при pH 6,8. Использование воды другой реакции может привести к плохой, нежелательной, а в ряде случаев и непригодной для цитологического исследования окраске препаратов.

Приготовление фиксатора Лейшмана: 2,5 сухого порошка краски Лейшмана растворяют в 1 л метилового спирта и оставляют на 3 дня в сосуде с притертой пробкой, периодически помешивая. Через 3 дня раствор фильтруют и помещают в другой сосуд. Раствор стоек.

ОКРАСКА ПО АЛЕКСЕЕВУ - МЕТОД СРОЧНОЙ ОКРАСКИ

Первый экспресс-метод срочной окраски по Н. Г. Алексееву.

На высушенные мазки наливают 5-10 капель готового раствора краски Романовского - Гимза, распределив равномерно по стеклу. Через 30 секунд на мазок наливают двойное количество подогретой до 50 - 60°С дистиллированной воды на 3-5 минут. Воду сливают, промывают мазки проточной водой, высушивают, аккуратно промокнув фильтровальной бумагой, и микроскопируют.

Второй метод срочной окраски по Н. Г. Алексееву.

Высушенный на воздухе мазок погружают в фиксатор Лейшмана на 30 секунд. Через 30 секунд фиксатор не сливают, а на препарат наливают горячий, нагретый до 50 - 60°С раствор краски Романовского-Гимза на 3 минуты. Смывают краску обычной водопроводной проточной водой. Высушивают препарат осторожно, промокая его фильтрованной бумагой. Время окраски 4 минуты.

Для фиксатора берут 4 г сухой краски Лейшмана и растворяют ее в 1 л метанола. Для приготовления краски берут 1,5 капли краски Романовского - Гимза на 1 мл нейтральной дистиллированной воды pH 6,8 - 7,0.

МЕТОД СРОЧНОЙ ОКРАСКИ ПО Т. П. ЯКИМОВОЙ

Свежеприготовленные мазки, слегка подсушенные на воздухе, погружают в 96%-ный спирт и сразу же вынимают, без экспозиции. Мазки, покачивая, несколько раз промывают в крупном сосуде с достаточным количеством водопроводной воды и наливают на предметное стекло краску гематоксилин (по Эрлиху) на 1 - 2 - 3 минуты. Через 1-2-3 минуты краску сливают, мазок промывают проточной водой, промокают фильтровальной бумагой и изучают под микроскопом. Время окраски 1-2-3 минуты, зависит от необходимости времени изучения нативного препарата.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСКИ ГЕМАТОКСИЛИН ПО ЭРЛИХУ

В широкогорлую посуду помещают 2 г гематоксилина, абсолютного спирта - 100 мл; глицерина - 100 мл; дистилированной воды - 100 мл; ледяной уксусной кислоты - 10 мл; смешивают и добавляют растолченные камейные квасцы в избытке (3 г). Посуду закрывают марлей и оставляют на свету до созревания краски - примерно на 14 дней, периодически взбалтывая. Краска после созревания имеет красно-фиолетовый цвет. Хранят краску в темном шкафу, в сосуде с плотной пробкой.

СПОСОБ ОКРАСКИ ПО ЭРЛИХУ

ОКРАСКА ПО ГРАМУ

Основой краски является кристаллический фиолетовый краситель, который отдельные бактерии удерживают после обесцвечивания в спирте, окрашиваясь в синий цвет, или не удерживают, и после обесцвечивания в спирте окрашиваются в красный цвет. В первом случае бактерии, окрашенные в синий цвет, называют грамположительными, а во втором случае бактерии, окрашенные в красный цвет, называют грамотрицательными. Существуют и грамвариабельные бактерии, которые могут окрашиваться как в темно-синий, так и в розовокрасный цвет.

СПОСОБ ОКРАСКИ ПО ГРАМУ

Высушенный на воздухе мазок фиксируют над пламенем горелки несколько секунд. На фиксированный мазок помещают кусочки фильтровальной бумаги, на которые наливают карболовый раствор кристаллического фиолетового красителя на 1 - 2 минуты. По истечении 1 - 2-х минут пинцетом удаляют фильтровальную бумагу и, не смывая краситель, на стекло наливают на 1 минуту раствор Люголя. Через 1 минуту раствор Люголя сливают и на стекло наносят несколько капель 96% спирта на 0,5-1 минуту, в течение которой стекло с нанесенным на мазок спиртом осторожно покачивают. После вышеуказанных процедур мазок промывают проточной водой и в течение 1 - 2-х минут докрашивают водным раствором фуксина Циля. После окрашивания мазка препарат вновь промывают проточной водой и высушивают на воздухе, после чего микроскопируют. При окрашивании необходимо строго соблюдать условия окрашивания, ибо недообесцвечивание или переобесцвечивание мазка в спирте приводит к ложной окраске.

Микроскопическое исследование всех мазков производится в двух оптических режимах: на малом увеличении с объективом х10, а затем на большом увеличении с иммерсионным объективом х90 или х100, при этом используют окуляр х7.

ОКРАСКА МЕТИЛЕНОВЫМ СИНИМ

Реактив для окрашивания - 1% водный раствор метиленового синего красителя. Для приготовления раствора 1 г метиленового синего красителя растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют.

Для окраски высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 3-х минут 96% этанолом. После фиксации препарат высушивают, наносят 1% раствор метиленового синего на 1 -10 минут в зависимости от характера материала и его количества. Чаще всего окрашивают препарат в течение 1 минуты. После окрашивания краску сливают и препарат промывают под струей проточной воды. Препарат высушивают и микроскопируют на малом увеличении с объективом х10 окуляром х7, а затем микроскопируют с иммерсионным объективом х90.