Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Третичная структура белка
Особенности рентгеноструктурного анализа как главного источника информации о пространственной структуре белка

Рентгеноструктурный анализ кристаллов белков является доминирующим методом определения их пространственной структуры. В последнее время развивается также изучение пространственного строения белков в растворах методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), однако эти исследования, значение которых нельзя переоценить, пока ограничиваются сравнительно небольшими белками.

Не вдаваясь в обсуждение техники рентгеноструктурного анализа, кратко рассмотрим возможные его ограничения. Поскольку с помощью рентгеноструктурного анализа изучают строение белковой молекулы в кристалле, важнейший вопрос состоит в том, насколько точно состояние этой молекулы в кристалле отражает ее строение, а значит, и поведение в растворе, которое существенно для ее биологической роли. Казалось бы, взаимодействия между белковыми глобулами, обязательно возникающие при кристаллизации, способны сильно исказить строение белка, что существенно уменьшило бы ценность метода. Однако, как показали многочисленные наблюдения, этого не происходит.

Такое заключение подтверждается, во-первых, тем, что данные о пространственной структуре белков в растворе, полученные методом ЯМР, согласуются с результатами рентгеноструктурного анализа. Во-вторых, в кристаллах некоторых ферментов удалось наблюдать каталитическую активность, что указывает на сохранение в кристалле конформации, присущей нативному белку. Более того, пропитывание кристаллов раствором субстрата (а чаще — его аналога), ставшее стандартным приемом кристаллографии белков, приводит к его связыванию в активном центре. Это опять-таки указывает на сохранение нативной структуры в кристалле. В-третьих, для белков, в кристаллах которых содержатся по-разному ориентированные молекулы, последние, несмотря на различие в контактах с «соседями», имеют практически идентичные пространственные структуры, если пренебречь некоторыми, обычно небольшими, отличиями в положении функциональных групп на поверхности контакта.

Заметим, что изменение конформации или отбор одной из нескольких конформаций при кристаллизации небольших органических соединений — события не столь уж необычные. Сохранение же конформации при кристаллизации белков обусловлено особенностями строения белковых кристаллов. Последние обязательно содержат большой объем воды, буферных солей — растворителя, из которого велась кристаллизация. Доля растворителя в белковых кристаллах достигает 50% и более к общему объему. Поэтому белковая молекула в кристалле, хотя и имеет целый ряд нековалентных контактов с соседними, остается как бы погруженной в ту же среду, где она находилась до кристаллизации. В частности, удается выявить слой из нескольких сотен молекул воды, непосредственно связанных с поверхностью белка и составляющих его гидратную оболочку. Таким образом, в силу своеобразия белковых кристаллов их образование не вызывает значительных структурных изменений в белке, и метод рентгеноструктурного анализа дает, как правило, картину, правильно отражающую строение белковой молекулы в растворе.

Следует, однако, указать на весьма существенное ограничение, связанное с тем, что динамика белковой структуры в кристалле ограничена контактами с соседними молекулами. Это особенно верно для крупных структурных перестроек, поэтому необходимо иметь в виду известную тенденцию приуменьшать динамические возможности белка, базируясь на результатах рентгеноструктурных исследований.