Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005
Химическое ;модифицирование белков
Особенности метода химического модифицирования
Химическое модифицирование, т.е проведение химических реакций, изменяющих ковалентную структуру белка, представляет собой один из важнейших приемов, используемых при характеристике функциональных групп белка. Метод долгое время доминировал в изучении структурно-функциональных отношений в белках, однако в последнее время он утратил монопольное положение, уступая во многих отношениях быстро развивающемуся сайт-специфическому мутагенезу. Тем не менее он в полной мере сохраняет значение как способ первичного поиска функционально значимых группировок в белковой молекуле, в особенности таких, которые наделены аномальной реакционной способностью (хотя на завершающих стадиях исследования метод сайт-специфического мутагенеза имеет серьезные преимущества).
Вместе с тем реакции химического модифицирования лежат в основе создания необратимых ингибиторов ферментов, используются при иммобилизации белков, особенно ферментов и антител, для биотехнологических задач, а также для изучения топографии поверхности белков и их локализации в сложных структурах, например мембранах и других надмолекулярных образованиях.
Реакции химической модификации белков очень многочисленны. Лишь немногие, наиболее представительные из них, будут рассматриваться далее.
Обсуждая особенности метода, прежде всего следует подчеркнуть яркую специфичность белков как объектов химического модифицирования. Нередко, приступая к химическому модифицированию, исследователь вынужден исходить из упрощенного представления о белке как носителе определенного набора функциональных групп, принадлежащих боковым цепям аминокислотных остатков. При этом химические свойства последних как бы приравниваются к хорошо описанным и достаточно просто предсказываемым свойствам соответствующих групп в низкомолекулярных соединениях, в частности в пептидах и аминокислотах. Обзор реагентов, применяемых для модификации белков, который будет дан ниже, по существу основан именно на таком упрощении.
Не следует, однако, забывать об ограниченности этого подхода. Действительно, часть функциональных групп, главным образом те, что расположены на поверхности глобулы, окружены водой и не входят в систему контактов с другими группировками белка. С достаточным приближением они могут рассматриваться как аналогичные по реакционной способности таким же группам в малых молекулах, в частности пептидах. Однако число таких «канонических» групп не столь уж велико и, главное, не ими определяется химическая специфичность, особенность белковой молекулы.
Можно указать три основные причины радикального изменения химической активности функциональных групп, включенных в макромолекулу белка.
1. Часть функциональных групп скрыта внутри глобулы и, следовательно, недоступна для химических реагентов (до тех пор, пока белок сохраняет нативную структуру). Так, в сравнительно небольшом белке — карбоксипептидазе А — полностью скрыты внутри глобулы один остаток тирозина и два триптофана; 13 остатков тирозина и 6 — триптофана находятся в поверхностном слое и частично доступны растворителю. Только четыре остатка тирозина погружены в окружающую белок воду' и могут проявлять такие же химические свойства, как тирозин в небольших пептидах. Реакции химической модификации, рассчитанные на полное замещение всех доступных групп данного типа, используют для подсчета и идентификации скрытых (англ. buried) функциональных групп.
2. Многие функциональные группы контактируют с соседними группировками в белке, образуя своеобразные ансамбли. Участие в таких ансамблях способно сильно, подчас до полной неузнавае мости, изменить реакционную способность партнеров. Это подтверждается, в частности, тем, что константы диссоциации и соответствующие им рКа ионогенных групп белка лежат в весьма широких диапазонах, иными словами, кислотно-основные свойства этих групп сильно зависят от их микроокружения.
Так, в небольших пептидах ω-карбоксильные группы боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот имеют рКа, близкий 4,7, будучи похожими в этом отношении на карбоксил уксусной и других алифатических карбоновых кислот. Во всей совокупности белков, однако, их рКа охватывают огромный интервал: от 1,5 (одна из карбоксильных групп активного центра пепсина) до 7,5 (карбоксильная группа остатка Glu-49 в а-субъединице триптофансинтетазы). Таким образом, в белках карбоксильные группы могут выступать и как весьма сильные кислотные группировки, практически полностью диссоциированные в физиологическом диапазоне pH, и как очень слабые, диссоциированные едва ли наполовину даже в нейтральной среде, а их константы диссоциации могут изменяться на шесть порядков.
Изменение реакционной способности той или иной функциональной группы может быть вызвано не только ее взаимодействием с какой-то другой группой (например, со второй карбоксильной группой, одна из которых становится сильной, а другая — слабой кислотой), но и локальным изменением полярности микроокружения данной группы. Например, полагают, что погружение ß-карбоксильной группы остатка Glu-35 в гидрофобный участок лизоцима куриного яйца затрудняет диссоциацию протона, поскольку образующийся при этом анион не может стабилизироваться гидратацией; рКа этой группы близок 6.
3. Поверхность белковой глобулы далеко не безразлична к реагентам, применяемым при модификации. Даже если эти реагенты не содержат специально подобранных структур, способствующих избирательному связыванию в той или иной зоне белка (так называемая аффинная модификация), они с большой вероятностью будут связываться белком за счет взаимодействия с заряженными группами, гидрофобными участками поверхности, донорами или акцепторами водородных связей и т.п Таким образом, собственно модификации предшествует связывание реагента определенным участком белковой структуры. Это приводит как бы к локальному концентрированию реагента в данной точке белковой молекулы и резко повышает вероятность вступления в реакцию функциональных групп, возможно случайно соседствующих с участком связывания реагента
Нетрудно видеть, что отмеченные выше особенности поведения белка в реакциях химической модификации не случайны, а отражают фундаментальные свойства его структурной организации и функционирования. С методической точки зрения это означает, что при трактовке результатов химической модификации нельзя полагаться на сведения о реакционной способности соответствующих групп в модельных соединениях. Строго говоря, в каждом случае после проведения реакции и выделения продукта модификации (иди разделения, если их несколько) необходимо прямыми методами установить, какие именно функциональные группы данного белка подвергались модификации, и определить, каким аминокислотным остаткам в полипептидной цепи белка они принадлежат. Таким образом, приводимый далее обзор реагентов и их реакций с функциональными группами белка дает лишь общую ориентировку относительно возможностей применения метода химического модифицирования.